Pour commencer, prélevez 10 millilitres de l’échantillon d’eau de diatomée dans un tube à centrifuger. Centrifuger le tube à 13 400 g pendant cinq minutes. À l’aide d’un pistolet à pipette, jeter soigneusement 9,8 millilitres de surnageant.
Transférez ensuite 200 microlitres de l’échantillon d’eau de diatomée enrichie dans un tube à centrifuger de deux millilitres. Ensuite, prenez 0,5 gramme de tissu de marge pulmonaire d’un corps humain noyé. À l’aide de ciseaux, coupez le tissu pulmonaire jusqu’à ce qu’il devienne boueux.
Pour l’extraction de l’ADN des échantillons de diatomées et de poumons, ajoutez d’abord des billes de verre aux deux échantillons. Après avoir bien mélangé les échantillons, ajoutez 40 microlitres de protéinase K dans les tubes. Après une incubation de 15 minutes à température ambiante, ajoutez 200 microlitres de tampon de liaison dans les deux tubes.
Mélangez immédiatement les échantillons à l’aide d’un mélangeur vortex pendant quatre minutes. Placez ensuite les tubes dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. jusqu’à ce que la solution devienne claire.
Ensuite, transférez la solution claire avec le précipité floculant. dans une colonne d’adsorption de trois centimètres de long remplie d’une matrice de silicium. Centrifuger la colonne à 8 000 G pendant 30 secondes.
Jetez ensuite le liquide usé dans le tube de collecte et remettez la colonne dans le tube de collecte. Ajoutez maintenant 500 microlitres du tampon d’élimination de l’inhibiteur dans la colonne et centrifugez à 13 400 G pendant 30 secondes. Après avoir éliminé les déchets liquides, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage dans la colonne et centrifugez à nouveau.
Après avoir éliminé le liquide usé, replacez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte vide. Centrifuger la colonne à 14 500 g pendant deux minutes pour éliminer le plus de tampon de lavage possible. Maintenant, retirez la colonne et placez-la dans un tube à centrifuger propre.
Ajouter 100 microlitres de tampon d’élution à la partie centrale de la membrane d’adsorption. Centrifuger la colonne à 13 400 g pendant une minute après une incubation de cinq minutes à température ambiante. Transférer la solution obtenue dans le tube de prélèvement dans la colonne d’adsorption avant de centrifuger à nouveau.
Stockez l’ADN de la diatomée éluée à une température de deux à huit degrés Celsius pour une utilisation future. L’électrophorèse sur gel d’agarose a montré des bandes d’ADN de diatomées entre 250 et 500 BP dans les échantillons d’eau et les tissus après amplification par PCR.
