Pour commencer, préchauffez les têtes de moustiques anophèles disséquées dans un tampon CCD à 37 degrés Celsius sur un bloc chauffant pendant cinq minutes. Transférez le tube avec les têtes de moustiques dans un four d’hybridation pour une rotation à 37 degrés Celsius. Ensuite, transférez tout le contenu du tube dans un verre de montre à dissection.
À l’aide d’une pince, ramassez les têtes ou les antennes détachées et fixez-les dans un millilitre du préfixateur. Dans un nutateur, faites tourner les têtes dans le préfixateur pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Pour effectuer une dissection tissulaire, rincez d’abord les têtes avec un millilitre de PBS-Tween à 0,1 % sur glace.
Transférez ensuite les têtes dans un verre de montre à dissection. À l’aide d’un microscope à dissection, retirez les tissus d’intérêt de la tête à l’aide d’une pince tranchante. Tenez la partie antérieure de la tête avec la pince et saisissez une antenne avec une autre pince à la base.
De même, retirez les palpes. Transférez les antennes et les palpes dans des tubes vides sans ADN/ARN placés sur de la glace. Déshydrater le tissu dans 400 microlitres de réactif déshydratant pendant une heure à température ambiante.
Remplacez ensuite le réactif déshydratant par 400 microlitres de méthanol absolu et déshydratez les tissus pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius. Une fois la fixation terminée, réhydratez les tissus dans une série de solutions de réhydratation graduées en quatre étapes pendant 10 minutes sur de la glace. Lavez ensuite les mouchoirs dans 400 microlitres de PBST pendant 10 minutes à température ambiante.
Incuber les tissus dans 400 microlitres de solution de protéinase K pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les tissus deux fois dans 400 microlitres de PBST pour arrêter la digestion enzymatique. Après l’ajout du post-fixateur, laver à nouveau le tissu avec du PBST avant l’hybridation de la sonde.
Immergez le tissu dans 400 microlitres de tampon d’hybridation de sonde pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le tampon et pré-hybridez le tissu dans 400 microlitres de tampon d’hybridation de sonde préchauffé pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Remplacez le tampon d’hybridation de sonde préchauffée par 400 microlitres de solution de sonde chauffée.
Placez le tube dans un nutator pendant deux nuits à 37 degrés Celsius. Placez ensuite le nutateur à l’intérieur d’un incubateur recouvert d’une boîte. Ensuite, nutez le tissu dans 400 microlitres de tampon de lavage de sonde à 37 degrés Celsius dans l’incubateur.
Après avoir lavé les tissus dans 5x SSCT, incuber dans 400 microlitres de tampon d’amplification pendant 10 minutes à température ambiante. Pipeter le tampon d’amplification du tube. Ajoutez ensuite un mélange d’épingles à cheveux chauffées, H1 et H2. Ensuite, pipetez 100 microlitres de tampon d’amplification.
Nutez le tissu pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante. Pour monter le tissu, placez d’abord cinq gouttes de solution de montage sur une lame de verre. Ensuite, à l’aide d’une pince, saisissez les échantillons de tissus lavés par leur base.
Plongez et rincez délicatement dans la série de gouttelettes de solution de montage. Ensuite, montez avec une solution de montage et placez une lamelle sur le tissu. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles avant l’imagerie.
L’analyse des fiches HCR du tissu olfactif du moustique anophèle femelle a révélé que les IR 41t1, IR75d et IR7t étaient moins abondants dans les antennes. IR64a était trois fois plus abondant que le reste des gènes candidats. La co-localisation des familles de récepteurs orco et IR25a a été observée dans l’antenne ainsi que dans le palpe maxillaire du moustique.
Les modèles de colocalisation suggèrent que les cellules positives IR76b expriment IR25a, tandis que les cellules positives IR8a co-localisent partiellement avec IR76b et IR25a.
