Pour commencer, remplissez chaque aiguille avec cinq microlitres de solution de nanocorps GFP marquée au fluor Alexa. Placez une lamelle de 25 x 25 millimètres sur une surface de lame en verre. Pipetez 40 microlitres d’huile halocarbonée sur la lame et étalez-la le long du périmètre de la lamelle.
Sous le microscope d’injection, positionnez la pointe de l’aiguille contre le bord de la lamelle immergée dans l’huile. Ajustez la pression d’air d’injection de la PicoPump en conséquence. Remplacez la lame de verre vide par la lame d’embryon de drosophile préparée.
Placez la pointe de l’aiguille d’injection perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Utilisez le manipulateur de stade XY pour guider les embryons vers l’aiguille jusqu’à ce que la pointe atteigne le centre du vitellus, et pompez deux à trois fois pour perfuser des anticorps dans le jaune. À l’aide du manipulateur de stade XY, éloignez les embryons de l’aiguille après l’injection et passez à l’embryon suivant.
Laissez les embryons incuber à 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité. Après l’incubation, identifiez les embryons sous une lentille à faible puissance avec un éclairage à fond clair et passez à une lentille 40X ou 63X pour une imagerie fluorescente haute résolution en direct. Après l’injection, le rapport signal/bruit du récepteur Notch s’améliore de manière significativement comparable à la qualité du signal de l’immunofluorescence.
De plus, l’injection d’anticorps a permis de caractériser temporellement la localisation de l’encoche à des intervalles de 45 secondes sans perte apparente de l’intensité du signal sur une fenêtre d’imagerie de cinq minutes. L’imagerie en direct de la phosphotyrosine embryonnaire a montré que la phosphorylation de la tyrosine est fortement enrichie au niveau des jonctions tricellulaires. De plus, une nouvelle deuxième population de signal phosphotyrosine a été observée sous le centre de la membrane apicale.
L’imagerie bicolore a révélé que cette population de signal phosphotyrosine est proche de la myosine médiane. De plus, la population médiale de phosphotyrosine présentait des schémas de coalescence et de dissipation pulsatiles similaires, comme le montre la myosine médiane.
