Pour commencer, ajoutez 500 microlitres de gel de culture chaud dans un puits dans une assiette de 24 puits. Transférez rapidement les incisives entières disséquées isolées de la souris dans le puits. Faites tourner la plaque plusieurs fois pour rincer les incisives.
Ajoutez 400 microlitres de gel de culture chaud dans une boîte de culture et transférez les incisives rincées dans la boîte. Orientez l’incisive pour positionner la région de l’anse cervicale au centre de la parabole et ajustez l’inclinaison de l’incisive apicale pour le plan d’imagerie souhaité. Une fois le gel pris, à l’aide d’une pince fine, retirez tout gel sur la région d’intérêt.
Ajouter environ 150 microlitres de milieu de culture chaud contre le bord de la boîte pour recouvrir l’échantillon. Placez la culture d’explants à 37 degrés Celsius pour permettre aux tissus de se déposer. Au bout d’une heure, allumez le microscope et le laser à deux photons.
Fixez la boîte de culture à l’adaptateur de platine et placez l’anneau adaptateur de profusion sur le dessus. Connectez l’adaptateur de platine à un régulateur de température pour maintenir la culture à 37 degrés Celsius. Connectez l’entrée et la sortie de la bague d’adaptation à une pompe de microprofusion.
Réglez la vitesse de profusion sur 20 et lancez la profusion du milieu sur l’échantillon. Placez un ACBR sur le dessus de la bague d’adaptation et soulevez la platine de manière à ce que l’objectif passe à travers l’ACBR pour entrer en contact avec le milieu de culture. Tournez la longueur d’onde du laser à 920 nanomètres pour visualiser la GFP.
Après avoir localisé l’échantillon à l’aide d’un oculaire, visualisez-le avec un logiciel de microscope, puis configurez une taille de pas en Z de quatre micromètres et un intervalle de temps de cinq minutes pendant 14 heures. Lancez l’imagerie time-lapse et enregistrez les fichiers suivants pour l’analyse des données en aval. En microscopie time-lapse du K14-Cre ; R26-rtTA ; tetO-H2B-GFP boucle cervicale, les signaux H2B-GFP ont été principalement observés dans la région trans-amplificatrice de la boucle cervicale, indiquant des divisions cellulaires actives.
De plus, la condensation et l’alignement des chromosomes au niveau de la plaque de métaphase dans les cellules mitotiques, suivis de leur ségrégation pendant l’anaphase et en deux cellules filles, ont été observés. La plupart des divisions cellulaires étaient perpendiculaires ou obliques par rapport à la membrane basale avec moins de divisions horizontales parallèles à la membrane basale. Des événements de division cellulaire ont également été observés dans K14-Cre ; Anses cervicales R26-mT/mG où toutes les membranes des cellules épithéliales ont été marquées en vert.
Les cellules mitotiques ont été identifiées par leur arrondi cellulaire et leur cytokinèse ultérieure. Dans K14-Cre ; Des anses cervicales R26-mT/mG, des divisions cellulaires horizontales et verticales ont également été observées.
