Pour développer une méthode LC-TIMS ToF MS/MS pour analyser les peptides d’histones protéolytiques, couplez une HPLC équipée d’une colonne C-18 avec un instrument commercial TIMS ToF MS avec une technologie passive exclusive. Ensuite, réglez les conditions de fonctionnement de l’ionisation par nanoélectronébulisation sur une tension capillaire de 4 500 volts, un décalage de plaque d’extrémité de 800 volts, une pression de nébulisation de trois bars, un gaz sec de 10 litres par minute et un chauffage sec de 200 degrés Celsius. Configurez les paramètres MS sur une énergie de collision de six électronvolts, une RF de collision de 1200 VPP, un temps de transfert de 75 microsecondes et un stockage de pré-impulsion de cinq microsecondes.
Ajustez le volume d’injection à 20 microlitres, correspondant à huit microgrammes de l’échantillon, et réglez le débit à 0,4 millilitre par minute. Après avoir saisi la chronologie de gradient spécifiée et l’essai d’acétonide avec des pourcentages d’acide formique à 0,1 %, sélectionnez OK dans les deux fenêtres contextuelles pour enregistrer la méthode. Exécutez un gradient de LC non linéaire de 60 minutes en utilisant de l’eau et de l’acétonitrile, tous deux contenant 0,1 % d’acide formique.
Vérifier l’élution de l’échantillon de la HPLC dans le TIMS ToF via l’ionisation par nanoélectronébulisation en mode d’ionisation positive. Pour identifier les séquences peptidiques et les sites de modification à l’aide de l’outil MS-Digest, générez une liste théorique de peptides à l’aide de Protein Prospector. Ensuite, effectuez une synthèse théorique en tenant compte des conditions de digestion, du type de modifications post-traductionnelles, de la gamme de taille des peptides, de la plage de détection de masse et du nombre potentiel de clivages manqués.
Pour analyser les données acquises, recherchez les masses à plusieurs états de charge, allant de plus un à plus quatre, pour chaque peptide théorique. Après avoir identifié chaque rapport masse/charge, sélectionnez le pic et confirmez le MSMS à l’aide d’une liste théorique d’ions de fragmentation basée sur la séquence peptidique. Y compris les modifications post-traductionnelles.
Les spectres de fragmentation des peptides ont révélé trois variantes peptidiques différentes avec diverses modifications post-transcriptionnelles, y compris des groupes propionyle et acétyle, à différentes positions. L’étalon d’histone H3 propionylé présentait des peptides plus longs que la version non modifiée. Les histones extraites des cellules HeLa S3 ont montré de multiples modèles de modification post-traductionnelle aux mêmes positions d’acides aminés.
