Pour commencer, utilisez des forceps pour retirer la graisse et le tissu conjonctif de la glande salivaire sous-maxillaire disséquée d’une souris euthanasiée. Placez ensuite le presse-étoupe dans un tube de collecte avec une solution HBSS glacée. Ensuite, utilisez une pince pour couper le gland en morceaux carrés d’un centimètre.
Faites chauffer l’agarose à 4 % à 50 degrés Celsius et versez la solution dans un plat de 35 millimètres. Versez une petite quantité de la solution d’agarose dans un plat séparé et ajoutez-y les morceaux de glande. Mélangez ensuite les morceaux dans l’excédent d’agarose pour l’enrober.
Ensuite, placez quatre à six morceaux de la glande à plat dans le premier plat avec de l’agarose. Placez le couvercle sur le plat et transférez-le dans une glacière, en recouvrant l’assiette de glace pour qu’elle refroidisse et prenne. Pour sectionner les morceaux de glande, utilisez d’abord un scalpel pour couper soigneusement autour du bloc d’agarose intégré à la glande.
Ensuite, appliquez une goutte de super colle sur le bloc d’agarose et fixez-le à la platine d’un vibratome. Remplissez maintenant la chambre du vibratome avec du PBS glacé contenant 1% de pénicilline streptomycine. À l’aide d’un scalpel, coupez l’excédent d’agarose et créez des espaces de cinq millimètres entre chaque morceau de glande.
Alignez la lame du vibratome avec le bloc d’agarose et définissez les points de départ et d’arrivée des sections. Coupez le bloc de tissu en sections de 150 micromètres d’épaisseur à basse vitesse et à fortes vibrations. Une fois les sections coupées, utilisez un pinceau pour ramasser les tranches et placez-les dans un plat avec un milieu RPMI préchauffé contenant les antibiotiques.
Pour cultiver les tranches sous-maxillaires, ajoutez d’abord 1,5 millilitre de milieu RPMI dans les puits d’une plaque à six puits. Placez des filtres de 0,4 micromètre dans les puits. Ensuite, à l’aide d’un pinceau, transférez soigneusement une à six tranches sur chaque filtre.
Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après avoir irradié certaines plaques expérimentales avec des rayons gamma pour induire des blessures, remettez les plaques dans l’incubateur. Ensuite, remplissez les puits d’une plaque à 24 puits avec 500 microlitres de milieux de culture.
À l’aide d’un pinceau, soulevez les tranches du filtre et plongez-les doucement dans les puits. Incuber les tranches dans les colorants nucléaires concernés. Ensuite, incubez les tranches avec des anticorps pendant deux heures à 37 degrés Celsius sous une légère agitation.
Plongez les tranches dans le milieu de culture trois fois pour les laver. Laissez les tranches incuber dans chaque solution de lavage pendant 10 minutes à température ambiante sous une légère agitation. Ensuite, utilisez une pince pour retirer le ruban d’une entretoise d’imagerie double face.
Collez l’entretoise au fond d’une plaque à six puits à fond de verre, puis pipetez 50 microlitres de milieu dans l’espace au centre de l’entretoise. Placez la tranche dans le support en veillant à ce qu’elle repose à plat. Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirez délicatement 20 microlitres de média de l’espace.
À l’aide d’une pince, retirez délicatement le ruban adhésif de la face supérieure de l’entretoise et placez une lamelle circulaire de 25 millimètres par-dessus. Appuyez sur les bords de l’entretoise pour assurer une fixation ferme de la lamelle. Imagez la tranche au microscope confocal.
Des tranches non irradiées de la glande sous-maxillaire cultivées pendant sept jours ont conservé leur signal MT et leur architecture épithéliale. Cependant, trois jours après l’irradiation, une atrophie des cellules acineuses et canalaires a été observée. Des cellules positives à la caspase ont été observées quatre jours après l’irradiation.
Des taux élevés de gamma H2AX ont été observés dans des tranches irradiées, ce qui indique des dommages à l’ADN in vivo. L’imagerie en temps réel des macrophages a confirmé la phagocytose des cellules épithéliales dans le modèle de culture en tranches. Les cellules individuelles peuvent être détectées et segmentées pour une analyse ultérieure du comportement des cellules, comme la migration.
