Pour commencer, rincez les larves de drosophile de stade L3 trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS froid. À l’aide de deux paires de pinces tranchantes, tenir la partie antérieure des larves et retirer environ 2/3 des tissus corporels. Tenez le premier 1/3 des larves avec une paire de pinces et les crochets buccaux avec l’autre paire.
Rétractez ensuite les crochets buccaux à l’intérieur des larves jusqu’à ce que les larves soient complètement inversées. Retirez les disques des pattes et le cerveau pour obtenir une carcasse larvaire inversée propre avec une paire de disques alaires attachés à la trachée. Transférez les disques à oreilles dans un tube à centrifuger d’un millilitre.
Fixer les disques alaires dans du paraformaldéhyde à 4% dilué dans du PBS pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation. Après la fixation, lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun avec de l’éthanol à 70 %. Retirez la tête, l’abdomen, les pattes et les ailes des mouches anesthésiées et placez les thorax disséqués dans du PBS froid.
Préfixer le thorax dans 4%paraformaldéhyde dilué dans 1%Triton pendant 20 minutes sous agitation. Ensuite, lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun en utilisant du PBT sous agitation. Positionnez les thoraxes sur un ruban adhésif double face sur une lame de verre et coupez-les en deux à l’aide d’une lame de microtome tranchante pour produire deux hémithoraces.
Fixez les hémithores dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 45 minutes sous agitation. Lavez les échantillons deux fois pendant 20 minutes chacun en utilisant du PBT sous agitation. Placez les hémithores dans du PBS froid et utilisez des pinces pour isoler soigneusement les muscles du vol indirect des hémithores.
Perméabiliser les muscles dans de l’éthanol à 70 % pendant deux à sept jours à quatre degrés Celsius. Après perméabilisation, lavez les IFM deux fois pendant 20 minutes chacun à l’aide d’un tampon A.Ajoutez ensuite 400 microlitres du tampon d’hybridation et pré-hybridez les muscles pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un mélangeur thermique. Ajouter 100 microlitres de tampon d’hybridation fraîchement préparé contenant la sonde et l’anticorps primaire.
Incuber les échantillons dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pendant 16 heures à 300 tr/min dans un mélangeur thermique. Après l’incubation, lavez les échantillons trois fois à l’aide d’un tampon chaud A pendant 10 minutes chacun. Ensuite, incubez les échantillons dans de l’anticorps secondaire et du DAPI dilué dans un tampon A à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Lavez les échantillons trois fois avec un tampon B pendant 20 minutes chacun avant de les transférer sur une lame de microscope. Essuyez le tampon résiduel B et ajoutez 30 microlitres de support de montage sur la lame. Placez une lamelle de 18 x 18 millimètres sur la lame et scellez la lamelle à l’aide d’un vernis à ongles.
