1 2 Pour commencer, observez les cellules HEK 293T3 24 heures avant la transfection 4 dans une boîte de 15 centimètres contenant du GMEN. 5 Incuber les cellules à 37 degrés Celsius 6 et 5 % de dioxyde de carbone 7 jusqu’à ce qu’elles atteignent 40 à 50 % de confluence. 8 Étiquetez trois tubes en plastique de 15 millilitres 9 avec le nom de lentivirus approprié.
10 Ajouter 1,710 millilitres de sérum réduit, 11 et 90 microlitres de réactif de transfection dans chaque tube. 12 Mélangez le contenu en tourbillonnant 13 avant d’incuber les tubes à température ambiante. 14 Après cinq minutes, ajoutez le mélange de vecteurs d’emballage 15 au milieu de transfection et au vortex.
16 Ajoutez ensuite 7,5 microgrammes du vecteur de reprogrammation 17 et du contrôle pWPT-GFP 18 au mélange de transfection respectif. 19 Agitez les tubes pendant deux secondes 20 avant d’incuber pendant 15 minutes à température ambiante. 21 Pour transfecter les cellules 293T avec chaque lentivirus, 22 goutte à goutte, ajoutez un mélange d’ADN de transfection dans la boîte.
23 Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius 24 et 5 % de dioxyde de carbone. 25 Après 14 à 16 heures, 26 remplacer le milieu par 30 millilitres 27 de milieu frais 293T 28 et poursuivre l’incubation pendant 60 à 72 heures. 29 Observez les cellules tous les jours 30 et vérifiez l’efficacité de la transfection.
31 Ensuite, transférez la culture de transfection virale 32 dans des tubes de 15 millilitres 33 et faites-la tourner à 1 932 g pendant 10 minutes 34 à quatre degrés Celsius. 35 Filtrez le surnageant lentiviral 36 à l’aide d’un filtre de seringue de 0,45 micron 37 dans un nouveau tube de 50 millilitres. 38 Un jour avant la transduction du lentivirus, 39 préparer deux puits d’une plaque de 6 puits 40 contenant 100 000 cellules PDAC par puits.
41 Préparez deux tubes de 15 millilitres 42 avec deux millilitres de milieu PDAC préchauffé. 43 Dans le premier tube, 44 ajouter 12 millilitres de lentivirus de reprogrammation. 45 Ajoutez ensuite 12 microlitres de polybrène 46 et mélangez par pipetage.
47 Au deuxième tube, 48 ajoutez deux microlitres de polybrène. 49 Maintenant, retirez soigneusement le milieu de chaque puits 50 d’une plaque à 6 puits 51 et lavez-le une fois avec du PBS à température ambiante. 52 Ajouter le milieu de reprogrammation de l’infection 53 du premier tube au premier puits.
54 Ajouter le mélange du tube deux dans le deuxième puits. 55 Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius 56 avec 5% de dioxyde de carbone et 5% d’oxygène. 57 Le lendemain, remplacer le milieu 58 des deux puits par du milieu 59 PDAC frais et poursuivre l’incubation 60 jusqu’à 48 heures, comme il est démontré.
