1 Pour commencer, enduisez la plaque de 6 puits2 avec deux millilitres de solution de gélatine à 0,2 % par puits. 3 Incuber la plaque à 37 degrés Celsius 4 et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. 5 Ensuite, ajoutez goutte à goutte des iMEF dans un tube de 15 millilitres 6 contenant 10 millilitres 7 de milieu de fibroblaste humain préchauffé, 8 et mélangez en inversant doucement le tube.
9 Centrifuger la suspension cellulaire à 309 G pendant trois minutes. 10 Et retirez le surnageant avant de remettre le granulé en suspension 11 dans 12 millilitres de milieu de fibroblaste humain. 12 Placez deux millilitres de suspension cellulaire 13 dans chaque puits de la plaque à six puits recouverte de gélatine.
14 Et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius 15 et 5% de dioxyde de carbone. 16 Jetez le milieu du PDAC infecté par le lentivirus 17 et non infecté, et lavez les cellules deux fois avec du PBS. 18 Ajoutez ensuite 500 microlitres de trypsine pour dissocier les cellules.
19 Et incuber à 37 degrés Celsius 20 avec 5% de dioxyde de carbone et 5% d’oxygène 21 pendant 15 minutes. 22 Centrifugez la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes. 23 Et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu PDAC.
24 Lavez la plaque iMEF avec du médium PDAC. 25 Ajoutez ensuite 50 000 cellules PDAC infectées par des lentivirus 26 par puits dans cinq puits de plaque iMEF, et incubez pendant la nuit 27 comme démontré précédemment. 28 Après avoir préparé le milieu de reprogrammation, 29 ajoutez 100 microlitres de fibroblastes basiques facteur de croissance 30 à 100 millilitres de milieu de reprogrammation.
31 Le lendemain, laver deux fois les cellules qui poussent sur les mangeoires iMEF 32 avec un milieu de reprogrammation préchauffé. 33 Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu dans chaque puits, 34 et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius 35 avec 5% de dioxyde de carbone et 3% d’oxygène. 36 Après avoir passé cinq fois le pool IPSC, 37 observent les colonies robustes 38 conservant une morphologie semblable à celle de l’ESC.
39 Le PDAC, le BxPc3, le 40 H6c7 et le fibroblaste humain 41 ont montré différents jours de reprogrammation 42 pour former une morphologie mature de type ESC. 43 lignées clonales IPSC ont été établies, 44 à partir de chaque reprogrammation de cellules PDAC, 45 cellules BxPc3, H6c7, 46 et de fibroblastes humains. 47 Toutes les lignées IPSC établies ont obtenu une coloration positive 48 pour TRA-160, confirmant leur reprogrammation à la pluripotence.
