Pour commencer, isolez l’oreillette gauche et les veines pulmonaires ou PV du cœur de la souris. Placez le tissu isolé dans un cryomoule avec la base du cœur et l’apex du poumon vers le haut. Détournez et démêlez les PV au cas où ils seraient alambiqués.
Ensuite, remplissez le cryomoule avec le composé OCT. À l’aide d’une pince fine, appliquez une légère compression sur les PV sans les déplacer pour éliminer l’air résiduel. Congelez le tissu dans le composé OCT sur de la glace sèche.
Pour l’immunomarquage, décongelez les lames PV de souris congelées sur un système de coloration pendant 20 minutes. Administrez ensuite plusieurs gouttes d’une solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4 % sur les sections pour fixer le tissu à la lame. Après l’incubation, déplacez les lames sur une grille verticale et plongez-les dans un récipient rempli de PBS.
Placez le récipient sur un agitateur lent pendant cinq minutes pour rincer les lames. À l’aide d’un stylo bloqueur de liquide contenant du xylol, encerclez chaque section de chaque lame. Et réorganisez les lames sur le système de coloration.
À l’aide d’une pipette Pasteur, appliquer une ou deux gouttes de solution de perméabilisation sur chaque échantillon. Ensuite, nettoyez la solution Triton X-100 en lavant les lames pendant cinq minutes dans du PBS. Après avoir réorganisé les lames sur le système de coloration, ajoutez une ou deux gouttes du tampon de blocage à chaque section, en assurant une couverture complète.
Ensuite, préparez un millilitre du mélange d’anticorps primaires composé des anticorps primaires et du tampon bloquant. Jetez le tampon de blocage restant de la diapositive. Administrer deux ou trois gouttes du mélange d’anticorps primaires à chaque section.
Après l’incubation, placez les lames dans une grille verticale et rincez-les pendant cinq minutes dans un tampon de lavage tout en maintenant une légère agitation. Ensuite, préparez un millilitre du mélange d’anticorps secondaires composé des anticorps secondaires et du tampon de lavage. Repositionnez les lames sur le système de coloration et utilisez une pipette pour distribuer deux ou trois gouttes du mélange d’anticorps secondaires sur chaque section.
Par la suite, nettoyez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune dans un tampon de lavage tout en secouant. Ensuite, ajoutez deux ou trois gouttes de la solution Hoechst 33342 à chaque section disposée sur le système de coloration. Placez les lames dans une grille verticale et rincez-les pendant cinq minutes dans un tampon de lavage en agitant doucement.
Ajoutez une ou deux gouttes de médium de montage fluorescent à chaque lame et scellez les lames avec des lamelles de recouvrement. La région de l’orifice de la veine pulmonaire à l’oreillette gauche et à la jonction de la veine pulmonaire, les veines extrapulmonaires et les veines interpulmonaires ont été observées sous un grossissement de 10X. Des signaux cTnT spécifiques avec une striation musculaire typique dans l’orifice de la veine pulmonaire, les veines extrapulmonaires et les veines intrapulmonaires, ont été observés à un grossissement de 40X.
Cx43 a été trouvé dans les trois régions pulmonaires et a été principalement projeté entre les cardiomyocytes voisins. Des signaux liés à Cx43 ont été observés du côté polaire et du côté latéral des cardiomyocytes dans les manchons myocardiques.
