Pour commencer, ensemencez des cellules DAKIKI dans une plaque à six puits à une densité de six millions de cellules par puits. Mettez en place les différents groupes expérimentaux, et après le traitement correspondant, basé sur la méthode de regroupement, incubez les plaques pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Extrayez l’ARN total des cellules DAKIKI, en suivant les instructions du kit d’extraction d’ARN total.
Prélever un microlitre d’ARN extrait de chaque groupe d’échantillons pour mesurer sa concentration. Transcrivez inversement un microgramme d’ARN total de chaque échantillon en ADN complémentaire, en suivant les instructions du kit. Effectuez une amplification en chaîne par polymérase par transcription inverse ou RT-PCR pour détecter l’expression de chaque gène.
Après l’incubation initiale de 24 heures, prélever les cellules de chaque groupe. Ajoutez un volume approprié de solution de lyse cellulaire aux cellules collectées avant de les incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez les échantillons à 13 500 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et prélevez le surnageant pour une analyse plus approfondie.
Vortex les échantillons de protéines avec 5 fois le tampon de chargement de la page SDS dans un rapport de quatre pour un et chauffez les échantillons mélangés à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénaturer la protéine avant l’électrophorèse. Une fois le passage terminé, transférez le gel sur les membranes PVDF. Pour bloquer la membrane, incubez-la dans du lait écrémé à 5 % pendant deux heures à température ambiante.
Ensuite, incubez la membrane avec les anticorps primaires correspondants pendant 24 heures tout en utilisant l’anticorps bêta-actine comme contrôle interne. Ensuite, incubez les membranes avec l’anticorps IgG secondaire anti-lapin de chèvre correspondant à température ambiante pendant deux heures. Enfin, traitez les membranes avec une quantité appropriée de solution de travail de chimioluminescence améliorée pour la détection des bandes de protéines.
Les résultats quantitatifs de la RT-PCR ont montré que l’expression relative de l’ARNm de C1GalT1 et de Cosmc était régulée à la baisse dans les cellules DAKIKI du groupe modèle, par rapport au groupe témoin. La dioscine a régulé à la hausse l’ARNm relatif des deux degrés différents par rapport au groupe modèle. Les résultats du Western blot ont également montré que, par rapport au groupe témoin, l’expression protéique de C1GalT1 et de Cosmc dans les cellules DAKIKI du groupe modèle diminuait.
Les expressions protéiques ont été régulées à la hausse après l’intervention de dioscine.
