Pour commencer l’isolement des cellules individuelles des biopsies gastriques prélevées lors de l’endoscopie haute du patient, laissez d’abord le tissu se déposer au fond d’un tube conique de 15 millilitres. Une fois installé, utilisez une pipette pour aspirer le milieu et lavez les biopsies deux fois avec un millilitre de PBS supplémenté en antibiotiques. Transférez un minimum de 20 milligrammes de tissu dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de PBS complété par du DTT.
Utilisez des ciseaux de dissection fins pour couper le tissu en morceaux d’un à deux millimètres ou moins. Utilisez une mini-centrifugeuse de table pendant 15 secondes pour agréger les morceaux de tissu au fond du tube, puis aspirez autant de surnageant que possible. Ajoutez cinq millilitres de tampon de digestion fraîchement réchauffé dans un tube conique de 50 millilitres.
Transférez 500 microlitres du tampon de ce tube dans le tube de 1,5 millilitre contenant les morceaux de tissu. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez à 1 000 microlitres la pointe de la pipette à partir du bas pour augmenter le diamètre de la pointe afin de minimiser la perte de tissu. Maintenant, avec l’embout de pipette modifié, transférez les petits morceaux de tissu du tube de 1,5 millilitre au tampon de digestion dans le tube de 50 millilitres.
Incuber le tampon de digestion et le mélange de tissus à 37 degrés pendant 30 minutes avec agitation orbitale à 200 tr/min. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de trypsine réchauffée avec 0,25% d’EDTA au tissu dans le tampon de digestion et incubez. Neutralisez le tampon de digestion et la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu DMEM/F-12 avancé et faites passer la suspension à travers une passoire cellulaire de 70 microns.
