Lavez les cellules traitées ci-dessus avec du PBS glacé pour éliminer tout milieu résiduel et ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse RIPA contenant du PMSF pour lyser les cellules. Récupérez les cellules dans un tube. Incuber les cellules sur de la glace pendant quelques minutes pour assurer une lyse complète, puis centrifuger à quatre degrés Celsius à 12 000 g pendant 15 minutes.
Mélangez ensuite le lysat cellulaire avec un tampon de chargement et chauffez le mélange à 95 à 100 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes au bain-marie pour dénaturer les protéines. Chargez 10 microlitres de protéines totales de chaque échantillon sur un gel SDS0-PAGE. Faites fonctionner le gel sous une tension constante de 80 volts.
Arrêtez l’électrophorèse lorsque le bleu de bromophénol atteint le fond du gel de séparation. Ensuite, utilisez un système de transfert humide dans un bain de glace pour transférer les protéines séparées du gel sur une membrane de difluorure de polyvinylidène. Une fois le transfert terminé, retirez la membrane et incubez-la dans un tampon bloquant à température ambiante pendant environ une heure.
Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP. Visualisez les bandes protéiques sur la membrane à l’aide d’un substrat chimiluminescent et capturez le signal à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence. L’analyse par transfert Western a montré que l’expression supprimée de FAM83A augmentait les protéines Bax et caspase-3 clivée, diminuait l’expression de BCL-2 et augmentait la libération de cytochrome c.
