Pour commencer, placez des lamelles stériles dans les puits des boîtes de culture tissulaire à six puits et versez un volume adéquat de Poly-L-Lysine et de solution laminée dans les puits pour couvrir la lamelle. Ensuite, scellez la plaque avec une pellicule plastique pour réduire l’évaporation et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les lamelles trois fois avec du PBS stérile.
Ajouter deux millilitres de suspension cellulaire et de milieu de croissance pour plaquer 10 000 cellules dans chaque puits contenant la lamelle. Après avoir lavé les lamelles avec du PBS, fixez les cellules avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % et du PBS pendant 18 minutes. Rincez les lamelles trois fois avec du PBS pendant cinq minutes avant l’immunocoloration.
Incuber les lamelles immunocolorées et lavées dans un à cinq microgrammes de colorant Hoechst pendant 10 minutes. Lavez ensuite les lamelles avec du PBS pendant cinq minutes supplémentaires. Montez les lames en utilisant un rapport égal de mélange PBS et glycérol et capturez les images à l’aide d’un microscope fluorescent.
Traitez les cellules avec une solution de dissociation cellulaire non enzymatique pendant 30 secondes à une minute. Ajoutez ensuite cinq millilitres de DMEM pour chaque millilitre de réactif de dissociation cellulaire non enzymatique. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
Centrifugez les cellules à 5G pendant cinq minutes. Remettre les cellules en suspension à une concentration d’une à deux fois 10 des sixièmes cellules pour 100 microlitres de DMEM. Placez l’animal sur le ventre et stérilisez le site d’injection avec de l’éthanol à 70 %.
Injecter une à deux fois 10 des sixièmes cellules par voie sous-cutanée dans le flanc droit. Placez la souris seule dans une cage sans litière et laissez-la récupérer. Pour éviter l’hypothermie, placez une partie de la cage sur le coussin chauffant.
Des images de faible et haute puissance des cellules P0 GGF bêta 3 MPNST à passage précoce sont présentées. Les cellules se sont avérées tumorogènes, formant des colonies dans la gélose molle et des greffes chez les souris immunodéficientes.
