Avant le passage cellulaire. Enduire une plaque à six puits d’une solution de revêtement à froid et incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure, aspirer le milieu de cellules souches de la plaque à six puits contenant des cellules souches pluripotentes humaines et ajouter un millilitre de DPBS sans calcium et magnésium dans chaque puits. Après le deuxième lavage, ajoutez 500 microlitres de solution de dissociation dans chaque puits et incubez pendant deux à cinq minutes à température ambiante.
Pendant ce temps, aspirez la solution d’enrobage de la plaque à six puits et ajoutez un millilitre de DPBS sans calcium et magnésium dans chaque puits. Au microscope inversé, observez le processus de dissociation cellulaire. Lorsque 80 à 90 % des cellules semblent arrondies et adhérentes, aspirer la solution de dissociation des puits de la plaque à six puits.
Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de cellules souches contenant 10 inhibiteurs de roche micromolaires dans la plaque à six puits. Ajouter 10 microlitres de suspension cellulaire dissociée dans un tube. Ensuite, ajoutez un volume égal de bleu trypan.
Mélangez doucement et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Après le comptage des cellules, ajoutez deux millilitres de milieu de cellules souches par puits contenant 0,8 à 1 fois 10 à la 6e cellule par millilitre et 10 micromolaires d’inhibiteur de roche. Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière, d’un côté à l’autre, trois fois.
Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone. Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière et d’un côté à l’autre 10 fois avant d’incuber pendant deux heures. Décongeler le milieu de base pour les jours zéro et quatre et les suppléments sur de la glace.
Réchauffez deux millilitres chaque jour, un moyen et un moyen de lavage dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le milieu de cellules souches des puits d’une plaque à six puits et ajoutez deux millilitres de milieu de lavage un. Après avoir aspiré le milieu de lavage un, ajoutez immédiatement deux millilitres de milieu du premier jour sur le côté du puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Au 12e jour du processus de différenciation, traiter une plaque à six puits contenant des micropuits de 400 micromètres avec deux millilitres de solution de rinçage anti-adhérence. Sous un microscope inversé, observez la plaque à la recherche de bulles.
Si aucune bulle n’est observée, aspirez la solution de rinçage anti-adhérence et ajoutez immédiatement deux millilitres de produit de lavage deux. Ensuite, aspirez le milieu progéniteur pancréatique et ajoutez 0,5 millilitre de tampon de dissociation par puits. Incuber les cellules à température ambiante pendant deux à cinq minutes.
Lorsque la plupart des cellules sont arrondies et encore adhérentes, aspirez le tampon de dissociation et ajoutez immédiatement un millilitre de milieu chaud dans chaque puits. À l’aide d’une pointe de pipette P1000, dissociez doucement les cellules, en pipetant de haut en bas tout en utilisant alternativement un mouvement circulaire et en vous déplaçant de haut en bas du puits pour détacher les cellules uniformément dans tout le puits. Transférez le mélange de cellules dissociées dans un tube conique de 50 millilitres.
Ajoutez un millilitre de milieu à grappes dans la plaque à six puits pour recueillir toutes les cellules restantes. Ensuite, aspirez le milieu de lavage deux de la plaque à six puits du micropuits et ajoutez une suspension cellulaire dissociée. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.
Le lendemain, à l’aide d’une pointe de pipette P1000, prélevez lentement des grappes de la plaque à six puits du micropuits dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter un millilitre de milieu du jour 13 pour recueillir les grappes restantes et transférer les grappes dans le tube. Laissez les cellules se fixer naturellement sous l’effet de la gravité au fond du tube pendant cinq minutes.
Aspirer soigneusement le surnageant du tube sans perturber les amas de cellules. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu du jour 13 dans le tube. Mélangez délicatement en pipetant de haut en bas, en évitant l’aspiration de grappes.
Transférez la suspension sur une plaque à six puits très peu adhérente. Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière, d’un côté à l’autre, six fois. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.
Les images d’immunofluorescence des grappes ont montré une prédominance des cellules productrices d’insuline co-exprimant les marqueurs des cellules bêta pancréatiques. L’expression des gènes de signature des cellules bêta a révélé environ 25 % des cellules exprimant Nkx6.1 et 40 % exprimant Pdx1. Au cours de l’essai de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, les clusters dérivés de MEL1 ont sécrété des niveaux significativement plus élevés d’insuline en réponse à des concentrations élevées de glucose par rapport à de faibles concentrations de glucose.
