Pour commencer, prenez les sections de cerveau en paraffine de souris C57 black six injectées par PFF. Dépilez les lames en les trempant dans un substitut de xylène et en les incubant pendant deux minutes. Pour la réhydratation, trempez les lames dans de l’éthanol à 100 %, 95 % et 70 %, puis deux fois dans de l’eau déminéralisée.
Transférez les échantillons dans un récipient allant au micro-ondes avec de l’eau distillée doublement. Réchauffez le tampon 100 fois citrate avec un pH de six à quatre degrés Celsius. Préparez ensuite 350 millilitres de tampon de citrate frais.
Versez le tampon de citrate préparé dans un récipient en plastique avec un couvercle. Placez les lames dans le récipient tampon à citrate et fixez le couvercle. Passez les échantillons au micro-ondes à 700 watts pendant quatre minutes, puis laissez le temps de vous reposer pendant cinq minutes.
Passez au micro-ondes pendant encore 1,5 minute, suivi d’une période de repos de cinq minutes et reconstituez le tampon de citrate. Micro-ondes pendant 1,5 minute et laisser reposer pendant cinq minutes. Ensuite, refroidissez les échantillons et le tampon de citrate sur de la glace pendant 20 minutes et lavez-les avec de l’eau doublement distillée.
Séchez les lames d’échantillon à l’aide d’une serviette en papier sans toucher le mouchoir. À l’aide d’un stylo à papa, tracez des rectangles autour des morceaux de tissu. Transférez maintenant toutes les lames dans une boîte de coloration immunisée contre les lames.
Lavez-les délicatement plusieurs fois avec TBS-T en veillant à ce que les gouttes TBS-T restent dans les rectangles du stylo PAP. Tapotez les diapositives sur une serviette en papier pour retirer le TBS-T. Ajouter 50 microlitres de blocage dans chaque rectangle et incuber pendant une heure à température ambiante.
À la fin de l’incubation, à l’aide d’une serviette en papier, retirez la solution de blocage des échantillons. Pipeter doucement 50 microlitres du mélange d’anticorps primaires et de TBS-T dans chaque rectangle et incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez ensuite les lames avec TBS-T.
Retirez le TBS-T en tapotant sur une serviette en papier. Répétez ce processus trois fois. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de mélange d’anticorps secondaires à une dilution de une à 1000 dans du TBS-T dans chaque rectangle et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité.
Ensuite, lavez l’échantillon trois fois avec du TBS-T. Incuber ensuite l’échantillon avec du DAPI à une concentration de deux microgrammes par millilitre dans du TBS-T pendant une minute. Retirez la solution DAPI en tapotant sur une serviette en papier et lavez-la trois fois avec du TBS-T.
Pour monter une lamelle de verre, ajoutez deux gouttes par lame de réactif de montage aux échantillons. Appuyez doucement sur la lamelle pour éliminer les bulles et laissez sécher les échantillons pendant une heure à température ambiante. Imagez au moins 50 cellules dans divers domaines à l’aide d’un système d’imagerie par fluorescence à éclairage structuré équipé d’un objectif à huile 60 fois ou d’une technologie confocale.
Pour analyser les cellules, isolez la région d’intérêt en dessinant un contour autour de la cellule positive ou négative et en utilisant la fonction de recadrage. Ensuite, activez les descripteurs de forme et limitez-vous aux options de seuil dans la fonction de mesure définie. Ajustez le niveau de seuil en sélectionnant la fonction de seuil dans le menu de réglage.
Enfin, utilisez l’outil d’analyse des particules et définissez une taille appropriée pour capturer les mitochondries. Par exemple, réglez la taille sur 25 infinis, puis activez les unités de pixels et sélectionnez afficher les masques"Des lentilles de souris co-amino injectées de PFF substantielles colorées pour la tyrosine hydroxylase VDAC1, l’alpha-synucléine PS129 et le DAPI sont présentées. La coloration anti-alpha-synucléine PS129 a permis de distinguer les cellules qui hébergeaient des lésions PS129 des cellules saines.
L’analyse d’images de la coloration VDAC1 des neurones positifs à la tyrosine hydroxylase a révélé une réduction du nombre de mitochondries et du rapport d’aspect entre les neurones porteurs de lésions PS129 et les neurones dépourvus de celles-ci.
