Pour commencer, préparez le tampon 2X pour la RT-qPCR dans de l’eau exempte de DNase/RNase. Conservez le tampon à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit réutilisé. Ensuite, mélangez les amorces et les sondes dans un tube de 1,5 millilitre.
Complétez le volume avec le tampon d’élution. Conservez ensuite le tube à moins 20 degrés Celsius. Préparez un mélange enzymatique avec la Taq polymérase et le M-MLV RT dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace.
Complétez le volume avec le tampon de stockage de la polymérase Taq. Maintenant, remettez en suspension les ARN synthétiques viraux dans des tubes séparés avec 100 microlitres de tampon Tris-EDTA pour faire des stocks de 10 à six copies d’ARN par microlitre. Pour mélanger les stocks de virus, ajoutez cinq microlitres de SARS-CoV-2 influenza A et B à 50 microlitres de tampon Tris-EDTA.
De même, mélangez le SARS-CoV-2 et le MERS-CoV pour obtenir un deuxième mélange viral. Diluer les deux mélanges dix fois pour obtenir une dilution finale de 10 copies d’ARN par microlitre. À chaque puits d’une plaque de 96 puits, pipeter le tampon 2X, l’amorce, l’enzyme, l’eau libre de DNase/RNase et les mélanges d’ARN correspondants.
Scellez la plaque avec un joint adhésif pour plaque. Centrifugez ensuite la plaque pendant une minute pour recueillir le liquide au fond du puits. Ensuite, programmez la machine PCR pour qu’elle accepte le type de bloc rapide à 96 puits avec le type expérimental réglé sur la courbe standard.
Définissez les réactifs sur les réactifs TaqMan et sélectionnez les propriétés d’exécution standard. Définir les gènes cibles et le colorant rapporteur. Définissez ensuite les noms d’échantillons pour chaque réaction à tester et attribuez des cibles et des échantillons à la disposition des plaques.
Maintenant, entrez le programme de cycle dans l’instrument. Transférez la plaque sur la machine qPCR en temps réel dans le bon sens et appuyez sur run pour lancer le cycle. Choisissez l’emplacement du fichier pour enregistrer les données expérimentales.
Examinez ensuite les diagrammes d’amplification fournis par le programme qPCR. Les deux kits développés ont été capables d’amplifier avec succès les trois gènes cibles simultanément avec aussi peu que 10 copies d’ARN par réaction. Les efficacités d’amplification pour tous les titrages viraux étaient supérieures à 99 %
