Pour commencer, transformez la culture cellulaire d’Agrobacterium tumefaciens sur des plaques de gélose à la levure mannitol supplémentées en antibiotiques. Incuber les plaques pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur sur pied. Le lendemain, inoculer les colonies de la culture sur 12,5 millilitres de mélange de bouillon Levure Mannitol Luria-Bertani, et incuber sur un agitateur orbital à 28 degrés Celsius pendant 16 heures à 250 tr/min.
Inoculez 12,5 millilitres de la souche Agrobacterium LBA4404 dans 112,5 millilitres de bouillon de levure mannitol avec des antibiotiques. Incuber la culture sur un agitateur orbital à 28 degrés Celsius pendant 16 heures à 250 tr/min. Ajustez la culture de nuit à une densité optique de 0,4 avec le bouillon de culture.
Ajoutez ensuite 20 micromolaires d’acétosyringone avant l’incubation. Une fois que la culture incubée atteint une densité optique de un, centrifuger pour granuler les cellules. Remettre la pastille en suspension dans une solution en suspension à une densité optique de 0,6 et ajouter 200 micromolaires d’acétosyringone avant l’incubation.
Pour l’agroinfiltration, choisissez des plants de cacao ligneux qui ont des branches avec des feuilles. Ajouter 250 micromolaires d’acide jasmonique à la suspension d’Agrobacterium. Ensuite, installez un dessiccateur avec un vacuomètre comme chambre à vide pour mesurer la pression à l’intérieur.
Placez un anneau de jonction pour permettre le passage de la branche de la plante. Placez le bécher avec la culture Agrobacterium à l’intérieur du dessiccateur, et placez la branche entre le dessiccateur et son couvercle, avec les feuilles souhaitées immergées dans la culture Agrobacterium. Ensuite, utilisez un matériau d’empreinte en silicone pour sceller les espaces entre l’anneau, la branche de la plante et le dessiccateur.
Une fois le matériau en silicone polymérisé, fermez le dessiccateur en ne laissant aucun espace, puis connectez-le à la pompe à vide. Démarrez la pompe à vide jusqu’à ce qu’elle atteigne moins 0,07 mégapascal. Lorsque la pression souhaitée est atteinte, fermez la soupape de pression et éteignez la pompe pour maintenir la pression pendant cinq minutes.
Ouvrez la soupape de pression progressivement et régulièrement pour rétablir la pression de la chambre. Après avoir répété l’infiltration deux fois de plus, retirez la branche de la suspension cellulaire. Nettoyez les feuilles infiltrées avec de l’eau distillée, puis placez les plantes à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 48 heures.
Après l’incubation, exposer le tissu infiltré à une photopériode de 16 heures de lumière et huit heures d’obscurité. Les feuilles infiltrées des plantes semblent plus foncées à certains endroits, ce qui indique une pénétration d’Agrobacterium. Le système rapporteur utilisé a produit une accumulation de bétalaïne sur les feuilles, qui peut être facilement observée sous forme de pigmentation rouge vif à l’œil nu.
On a observé que l’accumulation de bétalaïne variait avec la viabilité tissulaire.
