Pour commencer, décongelez les échantillons de plasma sanguin isolés à 37 degrés Celsius. Transférez 100 microlitres de chaque échantillon de plasma dans des tubes de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de tampon HBSA sans calcium dans chaque tube.
Centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le surnageant à 20 microlitres sans perturber la pastille. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon HBSA sans calcium dans chaque tube.
Pipetez ensuite de haut en bas pour reconstituer la pastille. Faire tourner chaque tube pendant quelques secondes pour assurer une répartition égale des vésicules extracellulaires. Ensuite, centrifugez à 20 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Encore une fois, aspirez le surnageant à 20 microlitres sans perturber la pastille. Reconstituez ensuite la pastille dans 80 microlitres de tampon HBSA sans calcium. Pipetez la suspension de haut en bas pour obtenir une suspension uniforme.
Pour mesurer l’activité du facteur tissulaire de la vésicule extracellulaire, pipetez d’abord 40 microlitres de l’échantillon de la vésicule extracellulaire dans deux puits d’une plaque à 96 puits. Dans le premier puits, ajoutez 11 microlitres d’une IgG anti-TF humaine inhibitrice de souris. Dans l’autre puits, ajoutez 11 microlitres d’IgG de souris témoin.
Après l’incubation, ajouter 50 microlitres de la solution de mélange de facteurs dans chaque puits. Couvrez l’assiette d’un film, puis incubez-la pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ajoutez 25 microlitres de tampon EDTA HBSA pour arrêter la génération du facteur Xa.
Reconstituer le substrat chromogène dans de l’eau distillée jusqu’à une concentration de quatre millimoles. Ajoutez maintenant 25 microlitres de substrat chromogène dans chaque puits. Couvrez l’assiette d’un film, puis enveloppez-la dans du papier d’aluminium.
Incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez la plaque à 1 500 g pendant une minute pour éliminer les bulles. Placez ensuite la plaque dans un lecteur de plaques à 405 nanomètres.
Utilisez la courbe standard générée avec le facteur tissulaire relipidant pour convertir la génération de facteur Xa de chaque puits. Calculez ensuite la génération du facteur Xa dépendant du facteur tissulaire. Six donneurs sur 11 répondaient aux lipopolysaccharides de manière moyenne à élevée, tandis que cinq donneurs sur 11 répondaient à de faibles lipopolysaccharides.
