Pour commencer, utilisez une pipette multicanaux pour pipeter 100 microlitres de cystéine millimolaire dans les puits d’une plaque à 96 puits dans un capuchon stérile. Après avoir incubé la plaque, aspirez soigneusement la solution du puits et évitez de rayer l’électrode. Rincez les puits deux fois avec de l’eau déminéralisée stérile.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de collagène de queue de rat fraîchement préparé, une solution dans chaque puits. Bien incuber la plaque pendant une heure sous une faible lumière avant de laver deux fois à l’eau déminéralisée. Ensuite, transférez les cellules endothéliales cérébrales récoltées dans une auge stérile fraîche.
À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits pour terminer l’ensemencement en 30 secondes, conservez un seul milieu de puits à des fins de modélisation mathématique. Sur un adaptateur de plaque à 96 puits, déplacez les clips rouges de chaque côté vers l’extérieur pour permettre l’insertion de la plaque. Alignez précisément le puits A de la plaque avec la région A de l’adaptateur et appliquez une légère pression sur le dessus de la plaque pour la maintenir solidement en place.
Verrouillez ensuite les clips rouges. Appuyez sur set up pour lancer l’instrument après avoir fermé l’incubateur, tous les puits correctement détectés seront indiqués par une couleur verte sur la carte de la plaque. Appuyez sur le bouton de vérification pour authentifier les lectures d’impédance absolue.
Utilisez maintenant le menu déroulant situé sous la carte des plaques pour sélectionner le type de plaque utilisé pour l’expérience. Sélectionnez multifréquence pour mesurer l’impédance à différentes fréquences de courant alternatif. Enfin, cliquez sur le bouton de démarrage pour commencer l’expérience.
Laisser les cellules proliférer jusqu’à ce qu’une monocouche à haute résistance se forme indiquée par une augmentation des ohms. Assurez-vous que la croissance cellulaire a atteint un plateau avant de préparer des solutions de traitement. Pour préparer des solutions de traitement, placez des tubes en grappe de polypropylène de 1,1 millilitre étiquetés dans des plaques de tubes en bandelettes.
Ajoutez trois cytokines ou cellules de traitement de 50 microlitres dans le tube en suivant une carte de plaque préétablie. Placez-les ensuite dans l’incubateur pour les réchauffer. Sur le logiciel EIS.
Cliquez sur pause pour interrompre temporairement l’expérience en cours. Lorsque vous y êtes invité, ouvrez l’incubateur et relâchez soigneusement les deux clips rouges tout en maintenant la plaque stable. L’expérience étant toujours en pause, transférez la plaque dans le capuchon stérile.
Retirez ensuite les tubes dénudés de traitement de l’incubateur. Avec une pipette multicanaux. Remettez soigneusement en suspension le contenu des tubes dénudés de traitement.
Maintenant, pipetez 100 microlitres de traitement à partir des tubes dénudés et transférez-les dans les puits appropriés sur la plaque à 96 puits, ajoutez uniquement un milieu complet dans les puits sans cellules. Essayez de terminer le pipetage en moins de cinq minutes, car un refroidissement excessif de la plaque pourrait affecter la résistance de la monocouche de cellules endothéliales. Refixez la plaque traitée à la machine, puis vérifiez l’impédance du puits d’électrode.
Vérifiez que les paramètres d’acquisition multifréquence et le catalogue de plaques corrects ont été sélectionnés. Appuyez ensuite sur reprendre pour poursuivre l’expérience. Une fois que l’expérience a progressé jusqu’au point final souhaité, appuyez sur Terminer pour sauvegarder automatiquement le fichier enregistré.
Accédez à fichier, puis cliquez sur exporter les données pour exporter les données sous forme de fichier XLS ou CSV pour une analyse plus approfondie. Une augmentation de la résistance a été observée sur 30 heures, indiquant la phase de croissance des cellules endothéliales. Pendant la phase de croissance, les cellules se sont stabilisées à différents niveaux au bout de 48 heures, la normalisation des mesures a permis une interprétation plus fiable des changements de résistance.
Un nombre incorrect de cellules endothéliales cérébrales avant le traitement a entraîné une phase de croissance fluctuante, qui a progressivement décliné pour devenir un plateau de résistance stable. L’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et du volume de chargement a permis d’obtenir une phase de croissance optimale. Les cytokines semblaient avoir un effet transitoire sur la barrière.
L’ajout de cellules de mélanome a considérablement réduit la résistance de la barrière. La barrière paracellulaire et la composante basolatérale ont fluctué avec l’ajout de cytokines, l’ajout de cellules de mélanome a entraîné une diminution plus importante de la barrière paracellulaire par rapport à la composante basolatérale.
