Commencez par plaquer les cellules SHSY 5Y dans des boîtes à cellules à fond de verre à une densité de 15 par 10 rayons à la puissance de quatre cellules par millilitre. Traiter les cellules avec de l’acide rétinoïque tout-trans dans un milieu de culture contenant 1 % de FBS pendant cinq jours, suivi d’un traitement avec du facteur neurotrophique dérivé du cerveau pendant deux jours. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS stérile.
Traiter les cellules pendant 72 heures avec 10 à 7 agonistes de la PR molaire ou des isoformes en utilisant des parties égales de milieu MEM et F12 combiné à 1 % de FBS. Remplacer le milieu par un milieu de culture frais contenant 1 % de FBS mélangé à 20 nano molaires de TMRM pendant 45 minutes. Placez les cellules dans un incubateur connecté à un microscope confocal à balayage laser réglé à 37 degrés Celsius.
Capturez les images à l’aide d’un objectif apochromatique à immersion dans l’huile 63x. Réglez la taille de l’image sur 512 x 512 pixels avec une ouverture sténopé d’une unité de surface. Collectez une série chronologique de 15 images de cinq champs visuels différents dans chaque plaque cellulaire et une pile Z de huit plans Z équidistants.
Le fichier LSM résultant doit contenir des données de temps, de position et de pile Z.
