Pour commencer, prenez un tube avec des organoïdes dérivés du patient ou une suspension PDO dans une quantité égale d’extraits de membrane basale, ou BME. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, ensemencez cinq dômes de microlitres au centre de chaque puits d’une plaque préchauffée de 96 puits. Après avoir ensemencé tous les puits, placez le couvercle sur la plaque et retournez-le doucement.
Incuber la plaque inversée à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’incubateur de culture tissulaire pour permettre aux dômes de se solidifier. Retournez l’assiette de manière à ce que le couvercle soit orienté vers le haut. Puis incuber à nouveau.
Après avoir ajouté des colorants fluorescents et des médicaments aux plaques contenant les AOP. Placez l’assiette dans la citation cinq. Démarrez le logiciel Gen5 et dans la fenêtre du gestionnaire de tâches, sélectionnez le mode manuel imageur et cliquez sur capturer maintenant.
Dans les paramètres, spécifiez l’objectif, le filtre, le format de microplaque et le type de récipient, sélectionnez utiliser le couvercle et utiliser une vitesse de support plus lente, puis cliquez sur OK. Choisissez ensuite un puits d’intérêt. Sélectionnez le canal en fond clair, cliquez sur l’exposition automatique et ajustez les paramètres selon vos besoins.
Ensuite, pour configurer la pile Z, développez l’onglet du mode d’imagerie, sélectionnez Pile Z et ajustez la mise au point à l’aide des flèches de réglage de trajectoire jusqu’à ce que tous les PDO soient flous. Établissez ce point comme le bas de la pile Z et répétez l’opération à l’envers pour définir le haut. Ensuite, configurez les canaux fluorescents en ouvrant l’étape d’édition d’imagerie.
Sous Canaux, sélectionnez le nombre de canaux souhaité, désignez un canal pour le fond clair et des canaux supplémentaires pour chaque canal fluorescent. Fermez la fenêtre en cliquant sur OK, changez le menu déroulant en GFP pour régler l’exposition du premier canal fluorescent, cliquez sur exposition automatique et ajustez les paramètres d’exposition sous l’onglet Exposition pour réduire le signal de fond. Pour copier les paramètres d’exposition dans l’onglet Mode image, cliquez sur l’icône de copie, puis sur Modifier l’étape d’imagerie pour ouvrir une nouvelle fenêtre.
Dans le canal GFP, cliquez sur l’icône du presse-papiers dans la ligne d’exposition pour ajouter des paramètres d’éclairage, de temps d’intégration et de gain de caméra au canal. Cliquez maintenant sur l’icône de l’appareil photo et choisissez le prétraitement de l’image sous Ajouter une étape de traitement. Dans l’onglet fond clair, décochez l’option Appliquer le prétraitement de l’image.
Pour chaque onglet de canal fluorescent, assurez-vous que l’option Appliquer le prétraitement de l’image est cochée. Désélectionnez, utilisez les mêmes options que le premier canal, puis cliquez sur OK pour fermer la fenêtre. Cliquez maintenant sur Z projection sous l’étape d’ajout de traitement, ajustez la plage de tranches si nécessaire et fermez la fenêtre en cliquant sur OK.
Pour configurer le protocole d’imagerie cinétique, dans la barre d’outils, cliquez sur ensemble d’images et, dans le menu déroulant, choisissez Créer une expérience à partir de cet ensemble d’images. Cliquez sur les options sous l’autre rubrique et cochez la case procédure cinétique discontinue. Sous Temps total estimé, entrez la durée d’exécution de l’expérience.
Fermez la fenêtre en cliquant sur OK. De plus, définissez la disposition des plaques et le gradient de température à ce moment-là. Validez les étapes de réduction des données en cliquant dans les fenêtres.
Accédez ensuite à fichier et cliquez sur enregistrer le protocole sous dans la barre d’outils. Sélectionnez un emplacement de sauvegarde. Entrez un nom de fichier et cliquez sur Enregistrer.
Pour commencer l’imagerie cinétique, chargez le protocole dans le logiciel de planification à la demande du spa bio et choisissez un créneau disponible. Dans l’onglet Informations sur la procédure, sélectionnez l’utilisateur dans le menu. À côté de l’emplacement de protocole, cliquez sur sélectionner et choisissez Ajouter une nouvelle entrée.
Cliquez maintenant sur sélectionner à côté de l’emplacement de protocole. Cliquez sur Ouvrir pour naviguer et importer le protocole dans le logiciel de planification. Entrez la durée d’imagerie requise pour la plaque et cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
Sous Intervalle, entrez la fréquence d’imagerie souhaitée, sélectionnez le programme, la plaque ou le récipient pour lancer la séquence de validation des plaques, cliquez sur oui pour accepter ce programme.
