Séparation magnétique de cellules souches CD34⁺ résidant dans la paroi vasculaire isolées des artères murines, aortales et mésentériques pour des études cardiovasculaires

Pour commencer, isolez et cultivez la couche externe de l’aorte et la première branche des artères mésentériques isolées de la souris anesthésiée. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %, centrifugez la suspension cellulaire dissociée à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante, jetez complètement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 98 microlitres de tampon de tri pour 10 millions de cellules totales. Après l’ajout de l’anticorps CD34, incubez les cellules dans l’obscurité pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Pour laver les cellules, ajoutez deux millilitres de tampon de tri dans les cellules et centrifugez à 300G pendant 10 minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 80 microlitres de tampon de tri. Ajoutez ensuite 20 microlitres de Microbilles Anti-FITC à la suspension de la cellule.

Après avoir lavé et centrifugé les cellules comme démontré précédemment, remettre les cellules en suspension dans un millilitre de tampon de tri. Ensuite, positionnez une colonne de séparation magnétique dans le champ magnétique d’un séparateur et placez un tube de collecte sous la colonne. Après le rinçage avec 500 microlitres de tampon, chargez la suspension cellulaire dans la colonne et collectez le flux contenant des cellules non marquées dans le tube de collecte.

Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube à centrifuger frais de 15 millilitres. Introduisez 500 microlitres de tampon de tri dans la colonne et enfoncez le piston dans la colonne pour évacuer les cellules marquées magnétiquement.