Pour commencer, coupez le papier filtre en une forme rectangulaire d’environ 17 x 20 millimètres et retirez les quatre coins. Ensuite, créez environ sept par 10 millimètres de centre creux dans le papier filtre. Fixez un anneau disponible dans le commerce à une couche de film flexible et créez un centre creux dans la couche de film flexible.
Placez un anneau préparé dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Après la pré-culture, récupérez l’œuf de l’incubateur et placez-le sur son axe long sur le plateau de la boîte à œufs. Nettoyez toute la surface de la coquille d’œuf avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la reposer pendant 15 minutes.
Tenez l’œuf sur son axe court et cassez-le en bas. Ouvrez l’œuf sur une boîte de Pétri propre de 100 millimètres pour en extraire le contenu. À l’aide d’une pipette, transvaser environ 10 millilitres d’albumine mince dans un tube de 15 millilitres pour une culture ex ovo.
Remplissez le puits central du plat de culture avec de l’albumine fine. À l’aide de papier de soie, retirez délicatement l’albumine épaisse attachée à la membrane vitelline de l’embryon. Maintenant, fixez soigneusement le papier filtre à la membrane vitelline, en vous assurant que l’axe du corps de l’embryon s’aligne avec le rectangle central sur le papier filtre.
Coupez la membrane entourant le papier filtre avec des ciseaux. À l’aide d’une pince à épiler, retirez doucement le papier filtre isolé de l’étrier dans une direction oblique. Retournez le papier filtre pour positionner l’embryon avec son côté dorsal vers le bas.
Plongez soigneusement l’ensemble du papier filtre d’un côté de l’axe long dans la boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du produit de lavage. À l’aide d’une pipette propre, vaporisez doucement le produit de lavage parallèlement au papier filtre pour éliminer tout jaune résiduel. Ensuite, retirez délicatement le papier filtre du milieu de lavage et utilisez du papier de soie pour absorber tout excès de milieu des bords de l’embryon.
Placez le papier filtre avec l’embryon sur la boîte de culture, en veillant à ce que la face dorsale de l’embryon soit orientée vers le bas. Transférer la boîte de culture dans l’incubateur sur scène pour la culture ex ovo. Remplissez les plats de culture avec un milieu de lavage chaud.
Lorsque l’embryon atteint un stade de développement souhaité, transférez le papier filtre avec l’embryon dans la boîte de culture remplie d’un milieu de lavage. Placez la boîte de culture dans l’incubateur sur scène du microscope Brillouin. Pour le processus d’étalonnage, mesurez le signal Brillouin de l’eau.
Ensuite, mesurez le signal Brillouin du méthanol. Sous l’imagerie en fond clair avec une lentille d’objectif quadruple, ajustez le point d’éclairage laser sur la deuxième paire de somites. Ensuite, passez à une lentille d’objectif 40 fois et effectuez un réglage fin du point laser au milieu du tube neural.
Débloquez le faisceau laser et ajustez le plan focal. Scanner l’embryon en utilisant une étape translationnelle bidimensionnelle et acquérir une image Brillouin de la région d’intérêt. Après avoir terminé l’examen, retirez soigneusement le papier filtre contenant l’embryon.
Utilisez du papier de soie pour absorber tout excès de produit de lavage de l’embryon. Remettez l’embryon dans la boîte de culture remplie d’albumine fine pour une culture continue. Pour la reconstruction d’images Brillouin, chargez les données de signal d’eau et de méthanol.
Cliquez sur définir la région et sélectionnez la région avec quatre points pour calculer les paramètres d’étalonnage. Enregistrez les résultats de l’étalonnage. Chargez les données de numérisation des embryons et cliquez sur Démarrer pour le traitement des paramètres.
Enfin, reconstruisez l’image Brillouin 2D en vous basant sur les décalages Brillouin de tous les pixels. Le décalage de Brillouin dans le module longitudinal estimé de la plaque neurale par rapport au nombre de somites et au temps d’incubation a montré une augmentation du décalage de Brillouin du tissu pendant la fermeture du tube neural.
