Pour commencer, placez les graines de Brassica napus DH12075 dans des micro-tubes. Pour dégraisser les graines, ajoutez de l’eau et 0,1 % de détergent dans le microtube et agitez pendant 60 secondes. Rincez maintenant les graines avec de l’eau suivie de 70% d’éthanol, chacune pendant 60 secondes.
Ensuite, placez les graines dans une solution d’hypochlorite de sodium à 10% et agitez pendant 20 minutes. Après avoir retiré l’eau de Javel, lavez les graines quatre fois avec de l’eau stérile pendant 60 secondes chacune. Placez les graines sur une boîte de Pétri contenant le milieu de germination des graines.
Stratifiez les graines à froid à quatre degrés Celsius pendant la nuit avant de déplacer le plat dans une salle de culture. Après cinq jours, transférez les plants dans une boîte de culture contenant un milieu de croissance des plantes. Inoculer Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 portant un plasmide poilu induisant les racines PRIA 4B dans cinq millilitres de milieu LB.
Cultivez la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle atteigne une densité optique de 600 nanomètres de 0,9 pour un. Transférez l’inoculum bactérien dans la seringue. À l’aide d’une aiguille de calibre 26 montée sur la seringue, percez l’hypocotyle d’un semis de 18 jours à environ un centimètre au-dessus du milieu de croissance.
Injectez environ 50 microlitres d’inoculum dans la plaie et grattez le tissu à la surface de l’hypocotyle. Remettez la plante dans la salle de culture à 21 degrés Celsius pendant deux à quatre semaines. Ensuite, coupez le cal avec les racines velues émergées de l’hypocotyle.
Placez le cal avec les racines poilues sur une boîte de Pétri contenant un milieu de croissance des racines velues et des antibiotiques pour supprimer la croissance des agrobactéries. Scellez le plat avec du ruban adhésif perméable au gaz avant de l’incuber à 24 degrés Celsius. Après l’incubation, isolez les racines poilues du cal et transférez les racines individuelles dans un milieu de croissance des racines poilues.
Alternativement, pour générer une plante composite composée de pousses de type sauvage et de racines poilues transgéniques, retirez les racines indigènes de la plante. Transférez ensuite la plante avec des racines velues émergentes dans une boîte de culture contenant un milieu de croissance et des antibiotiques pour supprimer la croissance agrobactérienne.
