Pour commencer, placez les graines d’Arabidopsis thaliana Col-0 stérilisées en surface sur une plaque contenant du milieu de germination des graines. Après deux jours de stratification à froid, déplacez l’assiette dans une salle de culture réglée à 21 degrés Celsius avec une photopériode de jour longue et 50% d’humidité. Transférez les plants d’une semaine dans une boîte de culture végétale avec un milieu de croissance pour plantes.
Cultiver la culture d’Agrobacterium tumefaciens dans un milieu LB jusqu’à ce qu’elle atteigne une densité optique à 600 nanomètres de 0,9 à 1. À l’aide d’une aiguille montée sur une seringue à insuline, injecter environ 50 microlitres de culture bactérienne à la base de la tige inflorescente primaire d’une plantule d’Arabidopsis âgée d’un mois. Grattez le tissu à la surface de la tige primaire avec la seringue.
Après deux à quatre semaines, excisez les racines velues émergentes et cultivez-les sur une boîte de Pétri avec le milieu de croissance des racines poilues complété par des antibiotiques pour supprimer la croissance agrobactérienne. Cultivez la racine poilue à 24 degrés Celsius dans l’obscurité. Après une à deux semaines, individualisez les racines poilues sur la plaque avec un milieu de croissance des racines poilues et transférez les lignes de racines poilues sélectionnées dans un milieu frais toutes les quatre à cinq semaines.
Transférez les racines poilues dans une plaque avec un milieu de régénération pour induire la formation de callosités et cultivez à 21 degrés Celsius lors d’une photopériode de longue journée. Une fois que les pousses émergent du durillon, coupez-les et transférez-les dans un milieu d’élongation des pousses pendant deux à trois semaines pour favoriser la croissance et l’élongation. Transférez ensuite les pousses allongées dans le milieu d’induction des racines.
Enfin, transférez la plante enracinée dans le sol pour effectuer une sélection transgénique. Chez A. thaliana, des cals jaunes ont été induits en 14 jours dans toutes les lignes racinaires poilues testées. Les premières pousses primordia, visibles sous forme de taches vert foncé, sont apparues dans les trois semaines suivant le transfert dans le milieu de régénération.
Après quatre semaines, les pousses ont recouvert les racines velues dans 90 % des lignées, certains cas montrant une formation fortuite de racines. Cependant, une lignée ne s’est pas régénérée même après trois mois. Par rapport au type sauvage, les régénérateurs racinaires poilus d’A. thaliana présentaient un phénotype nain avec des systèmes racinaires denses, des feuilles ridées et une période de floraison altérée.
