Souches de Shigella à trois stries sur des plaques de gélose contenant un colorant rouge Congo pour s’assurer que les colonies sont virulentes et pour empêcher l’utilisation de colonies non virulentes dans les tests d’infection. Pour commencer, prenez les cultures de Shigella cultivées pendant la nuit et vortexez-les. Ajoutez 100 microlitres de la culture à cinq millilitres de TSB frais dans un tube de culture.
Incuber les cultures à 37 degrés Celsius en agitant à 250 tr/min jusqu’à ce qu’une densité optique de 0,7 soit atteinte à 600 nanomètres. Transférer 2 fois 10 aux 8 unités formant colonies de Shigella sous-cultivée dans des tubes de microcentrifugation de 2 millilitres. Cellules à granulés par centrifugation à 17 000 g pendant deux minutes à température ambiante.
Aspirez le surnageant. Ajoutez un millilitre de PBS chaud et remettez soigneusement la pastille en suspension. Après avoir centrifugé à nouveau la cellule, remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de DMEM chaud et vortex la suspension cellulaire.
Ajoutez ensuite un millilitre de Shigella remis en suspension et un millilitre de DMEM dans chaque puits de monocouches épithéliales du côlon HT29 dans six plaques à puits. Pour assurer le contact bactérien avec les cellules HT29, centrifuger les six plaques à puits à 2 000 g pendant 10 minutes à température ambiante ou à 37 degrés Celsius. Incuber six plaques de puits à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 45 minutes.
Pour déterminer le titre d’infection bactérienne, préparez des dilutions en série de cellules Shigella remises en suspension dans le PBS. Plaquez 100 microlitres des dilutions 1 fois 10 à 5 et 1 fois 10 à 6 sur des plaques rouge Congo avec TSB, et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, aspirer le milieu de chaque puits.
Ajoutez un millilitre de PBS chaud dans chaque puits et lavez doucement. Ajoutez ensuite deux millilitres de DMEM chaud avec 50 microgrammes par millilitre de gentamycine et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Lavez les cellules HT29 infectées trois fois avec un millilitre de PBS.
Ajoutez deux millilitres de DMEM chaud avec de la gentamycine dans chaque puits et incubez jusqu’à 24 heures pour une réplication intracellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois avec un millilitre de PBS. Ajouter un millilitre de PBS avec 1% de Triton X-100 dans chaque puits pour lyser les cellules HT29.
Ensuite, à l’aide d’un grattoir cellulaire ou d’une pointe de pipette courbée, grattez les cellules lysées du fond du puits et transférez le mélange dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre. Vortex chaque tube pendant au moins 30 secondes pour déplacer davantage Shigella des cellules eucaryotes lysées. Préparer des dilutions en série décuplées des lysats et du PBS.
Plaquez 100 microlitres des dilutions en série sur des plaques rouge Congo avec du TSB et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
