Création de la carte de navigation pour CLEM et préparation des coupes ultraminces pour la microscopie électronique

Pour commencer, prenez une section ultra fine de tissu cérébral de souris exprimant mScarlet. Ajoutez 10 microlitres de tampon de montage sur la section ultra mince du verre de protection et placez un nouveau verre de couverture propre sur le tampon de montage. Placez les deux verres de protection avec la section ultra mince dans une chambre d’imagerie.

Localisez la coupe à l’aide du marqueur annulaire en mode d’imagerie en fond clair d’un microscope à fluorescence inversée et déplacez-vous vers un coin de la section. Allumez la lumière blanche et capturez l’image en fond clair. Éteignez ensuite la lumière blanche.

Activez le laser et capturez des images fluorescentes du même champ de vision. Désactivez le laser et déplacez-vous vers le champ de vision adjacent avec un chevauchement de 10 %. Capturez à la fois l’image en fond clair et l’image fluorescente du deuxième champ de vision et enregistrez le chemin d’imagerie pour assembler le champ de vision.

Utilisez maintenant la carte de navigation pour cibler les cellules d’intérêt. Activez le laser et capturez 300 images fluorescentes de la cellule d’intérêt. Ensuite, désactivez le laser.

Ensuite, activez la lumière blanche et prenez environ 100 images séquentielles en fond clair. Pour préparer les coupes pour la microscopie électronique, remplissez un bocal en verre d’eau distillée doublement. Retirez les verres de protection retenant les sections ultra-minces de la chambre d’imagerie et séparez-les avec une pince à épiler.

Fixez le verre de protection avec la section. Lavez le tampon de montage avec de l’eau doublement distillée et laissez-le sécher. À l’aide d’une lame unilatérale, marquez un hachage autour de la section ultra fine.

Déposez 10 microlitres d’acide fluorhydrique à 12 % à chaque coin du score. Placez lentement le verre de couverture dans l’eau. Faites ensuite flotter le film Pioloform et la lame ultra fine à la surface de l’eau.

Placez une grille de fente non couchée sur la section pour la capturer au centre de la grille. Couvrir une lame de verre avec du paraform. Prenez la grille avec le film Pioloform et laissez-la sécher à l’air libre à température ambiante.