Pour commencer, ajoutez un millilitre de matrice extracellulaire à 1 % dans chaque puits d’une plaque à six puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Après une heure, ajoutez deux millilitres de milieu d’entretien préchauffé contenant 0,4 micromolaire d’Y-27632 dans chaque puits.
Pour décongeler les cellules souches embryonnaires H9, secouez le stock cryovial dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes. Stérilisez soigneusement le cryoflacon avec un spray d’alcool désinfectant à 75 %. Transférez ensuite les cellules décongelées dans un tube de 15 millilitres contenant le milieu d’entretien et Y-27632.
Centrifuger le tube à 190 G pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez ensuite soigneusement la majeure partie du surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu d’entretien contenant du Y-27632. Distribuer 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque revêtue de matrice extracellulaire contenant le milieu d’entretien.
Secouez la plaque latéralement et incubez la plaque à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 24 heures. Changez de support tous les jours. Une fois que la densité de clonage atteint 70 %, retirez le milieu usé.
Après les lavages PBS 2D, incubez les cellules avec un millilitre d’EDTA pendant quatre à sept minutes à température ambiante et jetez complètement l’EDTA. Ajoutez un millilitre de milieu d’entretien dans les cellules et tapotez doucement la plaque. Transférez ensuite les cellules délogées dans un tube de 15 millilitres et mélangez-les trois à cinq fois.
Ajouter 20 à 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’un plat préalablement préparé recouvert d’ECM et bien mélanger. À l’aide d’un microscope, confirmez la densité cellulaire et incubez les cellules à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone.
