Pour commencer, décongelez et cultivez des cellules souches embryonnaires H9 dans un milieu d’entretien contenant du Y-27632. Au jour zéro, une fois que les colonies sont confluentes à 70 %, lavez-les avec 2 millilitres de DPBS, puis incubez les cellules avec 0,5 millilitre de solution de dissociation cellulaire contenant 20 micromoles par litre d’Y-27632. Pour interrompre la digestion, ajoutez 3 millilitres de milieu d’entretien contenant 20 micromoles par litre d’Y-27632.
Pour granuler les cellules, centrifuger le tube à 190 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu chimiquement défini sans facteur de croissance avec du Y-27632. Après avoir compté les cellules, ajoutez 1,2 million de cellules à 10 millilitres de milieu chimiquement défini sans facteur de croissance et mélangez bien.
Distribuez ensuite 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque inférieure conique de 96 puits. Incuber dans une atmosphère humidifiée à 5% de dioxyde de carbone. Pour induire la formation de rétine le sixième jour, ajoutez un milieu contenant BMP4 dans chaque puits d’une plaque à fond en V de 96 puits et incubez à nouveau.
Les jours neuf, 12 et 15, remplacez la moitié du milieu épuisé par du milieu frais sans BMP4. Le 18e jour, transférez soigneusement les corps embryoïdes formés dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Après la précipitation naturelle des corps embryoïdes, retirez délicatement le surnageant et rincez-le avec le milieu de différenciation de la rétine neurale.
Placez ensuite les corps embryoïdes dans une plaque à six puits à faible absorption et incubez à nouveau la plaque. Au jour 21, les images en fond clair ont montré une structure neuroépithéliale continue dans la rétine neurale générée à l’aide de cette méthode. Le taux de réussite de l’induction rétinienne était significativement plus élevé et les organoïdes rétiniens générés à l’aide de ce protocole étaient similaires en taille et en morphologie par rapport aux autres méthodes.
