Pour commencer, stérilisez et disséquez les yeux énucléés obtenus dans une boucherie inspectée par l’USDA, pour préparer l’œilleton. Placez délicatement l’œilleton, l’intérieur vers le haut, dans la boîte de Pétri contenant la passoire cellulaire. Ajoutez du DPBS refroidi dans l’œilleton, en vous assurant que le niveau de liquide est juste en dessous du point le plus bas de l’incision.
Sous une lampe de poche, trouvez les zones où la rétine neurale commence à se détacher de l’épithélium pigmentaire rétinien, puis utilisez une pince à épiler émoussée pour saisir doucement la rétine neurale soulevée et la décoller. Prélevez doucement la rétine neurale près du disque optique. À l’aide d’une pipette de pâturage fixée à un système d’aspiration intra-utérine, aspirez la rétine neurale.
Ajoutez délicatement des DPBS refroidis supplémentaires pour remplacer le volume aspiré. Maintenant, aspirez ce DPBS ajouté pour éliminer toute rétine neurale restante. Après avoir retiré la rétine neurale de tous les œilletons, ajoutez doucement de la trypsine dans chaque œilleton et replacez le couvercle de la boîte de Pétri.
Incuber les yeux avec de la trypsine à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Sous une lampe de poche, utilisez une pipette de mille microlitres pour déloger doucement les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien de chaque œilleton. Transférez les cellules délogées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.
Lavez l’œilleton avec un milieu de culture cellulaire pour recueillir les cellules restantes et neutraliser la trypsine. Mélangez ces cellules contenant des milieux avec des cellules précédemment collectées. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans trois millilitres de solution de travail Danase. Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 minutes.
Ensuite, centrifugez-le à 150G pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de milieu de culture cellulaire frais. Transférez les cellules obtenues de deux à trois yeux dans un puits d’une plaque à six puits et considérez cela comme le passage zéro.
Ensuite, transférez soigneusement la plaque à six puits ensemencée dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien ont été isolées des yeux porcins avec une pigmentation caractéristique évidente trois jours après l’isolement. Les cellules ont atteint leur pleine confluence après une semaine, ce qui indique une monocouche saine.
Les cultures présentant une morphologie anormale et une pigmentation excessive ont été reconnues comme contaminées et n’ont pas été utilisées dans les expériences.
