Pour commencer, prenez des VE isolés de cellules Calu6, transfectés avec du micro-ARN EV-conjugué au fluorophore et du micro-ARN cellulaire. Diluer les VE dans un volume approprié de PBS ultra-filtré pour préparer la suspension de vésicule extracellulaire à l’analyse par cytométrie en flux. Utilisez le nano-cytomètre en flux pour analyser des particules de taille nanométrique.
Lancez le logiciel et configurez l’instrument en suivant les instructions d’étalonnage recommandées. À l’aide de nanobilles de performance, effectuez le test de performance. Les performances de l’instrument sont jugées optimales si les nanobilles sont détectées dans la plage de taille standard.
Déterminer le débit approprié pour la détection des particules EV. Maintenant, effectuez un contrôle de qualité à l’aide d’eau filtrée ultra-pure pour vérifier la fluidique des instruments et évaluer les performances des détecteurs et des lasers. Configurez les paramètres pour évaluer la sensibilité et la résolution des différentes populations dans le mélange de billes conformément au protocole du fabricant.
Ensuite, appliquez un déclenchement approprié pour distinguer la population de billes du bruit de l’instrument. Ensuite, procédez soigneusement à un vortex des échantillons pour assurer une distribution uniforme des VE avant de les charger pour analyse. Lancez le logiciel d’analyse de données de cytométrie en flux et introduisez le PBS ultra-filtré.
À l’aide d’un PBS ultra-filtré, configurez le déclenchement pour les particules EV en vous assurant que le déclenchement correspond à la taille appropriée des particules en fonction de l’étalonnage. Prenez des VE qui ont été transférés et vortexés dans un tube compatible accordé et chargez le tube dans l’instrument. Capturez les signaux EV tout en traçant le FSC sur l’axe des x et le SSC sur l’axe des y.
Pour la détection de micro-ARN cellulaire sur l’axe des abscisses, sélectionnez le signal de fluorescence 1 et pour la détection du micro-ARN EV sur l’axe des ordonnées, choisissez le signal de fluorescence 2. Utilisation des échantillons EV isolés à partir de cellules transfectées avec un seul micro-ARN. Paramètres de compensation établis pour les fluorophores.
La cytométrie en flux a révélé une accumulation dépendante du temps de miR-451a, Alexa fluor-488 dans les véhicules électriques, ce qui permet un conditionnement et une libération efficaces. En revanche, la fluorescence de la cellule miR-67 n’a pas été observée chez les VE.
