Pour commencer le filage G/I, préparez un mélange de 20 microlitres sur de la glace avec de l’ARN total, un mélange de tampon de queue et un mélange d’enzymes de queue. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes dans un thermocycleur. Ensuite, ajoutez la solution d’arrêt de la queue et gardez sur la glace pendant deux minutes.
Effectuer la transcription inverse et l’amplification PCR. Après électrophorèse sur gel haute résolution des produits PCR, accédez aux données à l’aide du logiciel. Ouvrez le fichier XAD et sélectionnez des exemples de noms ou des échelles dans le panneau Arborescence.
Zoomez et dézoomez sur les électrophérogrammes et les images de type gel pour un affichage détaillé. Pour obtenir les tailles de pic, ouvrez l’électrophérogramme d’un échantillon sélectionné. Faites un clic droit sur l’électrophérogramme et sélectionnez l’intégration manuelle pour sélectionner manuellement les pics en faisant glisser la ligne horizontale.
Observez les valeurs de crête dans le tableau des pics et identifiez le pic avec la plus grande hauteur de pic. Activez l’icône Afficher/Masquer les points de consigne dans le menu supérieur. Un nouveau panneau apparaîtra sur le côté droit.
Sélectionnez Avancé, faites défiler jusqu’à Effectuer une analyse des frottis et cochez la case. Cela ajoutera la table Région à l’onglet Électrophérogramme. Sélectionnez ensuite un électrophérogramme et accédez au tableau Région.
Dans le menu De la paire de bases et À la paire de bases, définissez la paire de bases de début et de fin en cliquant avec le bouton droit sur l’électrophérogramme et en sélectionnant une région à ajouter. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur n’importe quelle cellule du tableau des régions et sélectionnez Modifier les régions pour créer une nouvelle fenêtre contextuelle pour définir des régions personnalisées. Utilisez cette équation pour calculer la longueur de la poly(A)queue sur l’ARNm d’intérêt.
Ensuite, dans l’onglet Électrophérogramme, cochez Afficher les tailles pour convertir automatiquement la table des régions de la paire de base à l’exécution. Ouvrez le fichier CSV et sélectionnez les valeurs obtenues pour l’exécution afin de générer un graphique. À l’aide de ce protocole, les longueurs de poly(A)tail des gènes Dscam1 et GAPDH des cerveaux larvaires de la drosophile ont été analysées tandis que les produits PCR des paires d’amorces spécifiques aux gènes ont montré une seule bande.
Les produits de PCR des paires d’amorces universelles spécifiques au gène ont montré des modèles de frottis distincts, indiquant une longueur poly(A) différentielle des ARNm. Les longueurs moyennes de la queue poly(A) ont été obtenues à l’aide d’une analyse des frottis. Et la gamme des longueurs de queue était représentée par des électrophérogrammes.
De même, l’analyse de la longueur de la poly(A)queue sur les cellules S2 a montré des longueurs de queue poly(A)différentielles pour les gènes SV43 prime UTR et GAPDH.
