Pour commencer, assurez-vous que la disposition du microscope est préparée sur la surface de la table optique avec toutes les distances mesurées avec précision. Montez ensuite le laser d’excitation sur la table. Réglez deux iris à la hauteur prévue du laser et utilisez ces iris pour vous assurer que le faisceau est de niveau et centré.
Positionnez l’étage de translation, ou TS1, sous l’emplacement du miroir 1, ou M1. Utilisez la paire d’iris réglée à la hauteur exacte pour définir la trajectoire de sortie du faisceau souhaitée et guider le placement et l’alignement de chaque élément réfléchissant. Ensuite, positionnez M1 en haut du TS1. Montez ensuite et alignez le dichroïque sur la table.
De même, montez le galvo et alignez-le avec les iris. Une fois les alignements effectués, positionnez M2 puis fixez M3 à la table. Ajustez la hauteur et la position jusqu’à ce que le faisceau soit à peu près centré sur les deux disques d’alignement en verre dépoli.
Ajoutez des supports à M3 ensuite. Ensuite, commencez à monter l’objectif 1 sur la table. Ajustez l’inclinaison et la position latérale jusqu’à ce que le faisceau soit centré sur les plaques de verre dépoli au-dessus de M3. Positionnez la lentille 2 et vérifiez la collimation en utilisant un miroir pour faire rebondir le faisceau sur une surface éloignée.
Utilisez une fiche ou une cible pour tracer la poutre et vous assurer qu’elle ne change pas de taille. Ajustez ensuite la position x, y du sténopé avec la monture XY et la distance axiale avec la platine unidimensionnelle pour maximiser la transmission. Ajustez la lentille 4 axialement pour focaliser le faisceau d’excitation sur la surface du galvo et disposez la lentille 3 sur la table, suivie de SL1.
Ajustez la distance axiale de SL1 pour former un télescope columé avec la lentille 4, puis positionnez TL1 parallèlement à SL1. Ajustez la hauteur de l’objectif 1 sur le système de cage jusqu’à ce que le faisceau forme un disque aéré au plafond. Et puis continuez à ajuster jusqu’à ce que la taille du disque soit minimisée.
Placez le miroir carré sur la platine d’échantillonnage de l’objectif 1 et ajustez le miroir axialement jusqu’à ce que la taille du profil du faisceau soit minimisée après le dichroïque. Montez le laser d’alignement en faisant glisser les tiges de cage dans les trous vides des deux plaques de cage. Utilisez un support de miroir cinématique et un miroir déroulant pour aligner les trajectoires des faisceaux d’alignement et d’excitation.
Positionnez le miroir carré axialement sur la platine d’échantillonnage de l’objectif 1 pour minimiser le profil du faisceau après le dichroïque. Insérer SL2 et TL2 dans le trajet d’émission aux distances respectives. Ajustez les boutons XY et l’inclinaison de l’objectif 2 de manière à ce que le faisceau d’alignement rouge passe à travers l’iris et le disque en verre dépoli.
Ajustez l’étape de translation 2 jusqu’à ce que le faisceau forme un petit disque aéré à la surface, puis continuez à ajuster l’étape de translation 2 pour minimiser la taille du disque aéré. Pour optimiser l’inclinaison du galvo dans le balayage des variantes, appuyez sur le bouton FSK du générateur de forme d’onde pour sélectionner un signal d’onde triangulaire pour le galvo et le régler sur une fréquence basse, telle que 1 hertz. Observez le faisceau d’alignement sur la même surface ou mur éloigné.
Montez l’objectif 3 à environ 4-5 millimètres devant l’objectif 2 à un angle de 0 degré et ajustez la hauteur en conséquence. Positionnez un disque d’alignement en verre dépoli dans le plan focal partagé entre SL2 et TL2 tel que mesuré avec une règle. Une fois que la lumière d’émission remplit l’ouverture arrière de O3, montez un disque en verre dépoli dans la position approximative du capteur de la caméra et alignez le centre du disque sur la lumière d’émission sortant d’O3. Positionnez TL3 derrière l’objectif 3 et ajustez l’inclinaison pour aligner la lumière sortante avec le disque en verre dépoli.
Placez la caméra à la distance mesurée de l’objectif du tube et ajustez l’objectif 3 axialement à partir de la platine de translation de la cage jusqu’à ce que le trou soit net sur la caméra. Réajustez l’objectif 3 à un angle de 30 degrés par rapport à l’axe optique de l’objectif 2 en utilisant les lignes sur la table comme guide. Remontez la cible de test de grille positive à la même hauteur axiale et éclairez la grille avec la lumière de champ vif.
Balayez horizontalement la partie nette du champ de vision sur l’écran tandis que les carrés de la grille conservent une taille uniforme. Pour aligner la feuille de lumière oblique, positionnez des lentilles cylindriques, ou CL, de sorte que le faisceau soit focalisé dans un profil de feuille horizontale au plan focal de CL3. Insérez et positionnez une fente dans l’orientation verticale au niveau du plan focal entre CL3 et l’objectif 3.
Au niveau du capteur de l’appareil photo, vérifiez que la feuille de lumière à 0 degré apparaît fine et verticale. À l’aide de la commande de l’étage de translation motorisé, déplacez M1 vers les lentilles cylindriques pour incliner la feuille de lumière. Insérez l’échantillon de test de microtubules marqué à la rhodamine pré-préparé sur la platine d’échantillon et ajustez-le axialement de sorte que le colorant soit éclairé par la feuille de lumière à cinq profondeurs différentes entre le centre du champ de vision et le côté droit de l’écran.
Enregistrez ensuite chaque image. Ouvrez les images en Fidji. Pour chaque image, à l’aide de l’outil Ligne, tracez une ligne horizontale du centre du champ de vision au centre de la feuille de lumière.
Allez ensuite dans Analyser, puis Tracer le profil pour calculer l’angle de la feuille de lumière au-dessus de 01. Après avoir calibré l’instrument, montez l’échantillon de billes tridimensionnelles pré-préparé et cliquez sur le bouton FSK du générateur de fonctions pour définir une onde triangulaire. Pour trouver l’échantillon, utilisez le générateur de fonctions pour définir les paramètres à partir d’une fréquence de 20 mégahertz, d’une amplitude crête à crête de 400 millivolts et d’un décalage de 0,4.
Faites défiler Z manuellement jusqu’à ce que le plan d’échantillonnage soit atteint et optimisez le réglage Z. Dans le programme micromanager, sélectionnez un temps d’exposition et ouvrez la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle. Définissez l’intervalle sur 30 et utilisez la zone de comptage pour choisir le nombre d’images.
Une fois les paramètres définis, enregistrez un laps de temps pour un balayage complet du volume. Les balayages volumétriques du réseau de microtubules reconstitués ont montré que les structures tridimensionnelles se densifiaient vers le centre, ce qui donnait des régions de fluorescence brillantes. Dans les plans d’imagerie près de la lamelle, la microscopie confocale a résolu les filaments uniques autour de la périphérie de l’Astar avec un arrière-plan supplémentaire vers le centre en raison de signaux fluorescents flous venant d’en haut.
Cependant, le déplacement de quelques microns en Z a rapidement réduit la qualité des images en raison des sections denses floues de l’Astar. L’éclairage à plan unique de la feuille de lumière a éliminé les signaux flous, permettant une qualité d’image comparable entre les plans.
