Pour commencer, cultivez le transformant de levure sélectionné dans trois millilitres de milieu SD URA à 30 degrés Celsius jusqu’à saturation. Mesurer la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Centrifuger deux millilitres de culture de nuit à 14 000 G à température ambiante.
Pipeter le surnageant. Remettre le granulé en suspension dans un millilitre de tampon MES. Centrifuger le mélange à 14 000 G à température ambiante.
Ensuite, retirez le surnageant. Après avoir lavé les cellules avec le tampon MES une fois de plus, remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de tampon MES. Ensuite, versez tout le volume dans un réservoir de réactif.
Ensuite, configurez le lecteur de microplaques. Accédez à l’icône de gestion du protocole, puis réglez le type de mesure sur l’intensité de fluorescence et le mode de lecture sur le balayage spectral. Saisissez le nom de la microplaque dans GREINER 96 F BOTTOM et réglez l’optique inférieure.
Accédez aux paramètres optiques en sélectionnant définir le balayage sur l’émission. Ajustez la longueur d’onde d’excitation à 433 nanomètres avec une bande passante d’excitation de 10 nanomètres. Réglez la gamme de longueurs d’onde d’émission de 460 nanomètres à 550 nanomètres avec une bande passante d’émission de 10 nanomètres et une largeur de pas d’un nanomètre.
Réglez le temps de réglage sur 0,1 seconde. Maintenant, préparez des concentrations variables de solution de chlorure de sodium dans les puits d’une plaque noire à fond transparent de 96 puits. Chargez 150 microlitres de tampon MES dans les trois premiers puits de la rangée A.Ensuite, pipetez 150 microlitres de la solution osmolite correspondante dans l’ordre croissant de gauche à droite.
Avec une micropipette à 12 canaux, pipeter plusieurs fois la suspension de levure lavée. Ensuite, transférez 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits. Pipeter le contenu de chaque puits plusieurs fois pour assurer un mélange uniforme.
Mesurez immédiatement les spectres d’émission d’intensité de fluorescence. Observez les spectres d’émission de fluorescence affichés à l’écran. Les constructions IDR ont montré une combinaison de spectres d’émission mCerulean3 et de citrine.
Pour AtLEA45, le stress hyperosmotique a provoqué une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur avec une diminution de l’intensité de fluorescence du donneur. Cela n’a pas été observé dans la construction de l’albumine.
