Effectuez le protocole à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité sur la souris euthanasiée correctement rasée et désinfectée avec de l’éthanol à 70%. Créez une incision superficielle de 0,5 pouce dans l’abdomen de l’animal à l’aide de ciseaux. Coupez longitudinalement le long de la ligne médiane vers le cou et le bas-ventre.
De plus, faites des entailles latérales pour ouvrir la peau. À l’aide d’une pince émoussée, séparez doucement la peau des tissus environnants, tout en faisant le tour du torse de l’animal en coupant la peau latéralement autour du cou et du bas-ventre. Placez soigneusement la peau avec le côté derme vers le bas dans une plaque de culture tissulaire de 100 millimètres.
Et assurez-vous que la peau est aussi étirée que possible. Ajoutez six millilitres de solution Dispase dans la plaque, en vous assurant que la peau est complètement recouverte. Ensuite, couvrez l’assiette.
Enveloppez l’assiette avec du Parafilm. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes pour aplatir l’explant. Le lendemain, à l’aide d’une pipette, retirez le liquide de la plaque contenant la peau isolée.
Ensuite, à l’aide d’une pince, séparez le derme de l’épiderme tout en enlevant tout tissu adipeux visible de celui-ci. Et placez le derme isolé dans une plaque de culture tissulaire propre. Ajouter un millilitre de DMEM contenant 1X solution antibiotique-antimycosique dans le derme dans la plaque de culture.
Inclinez la plaque pour accumuler le liquide sur un côté de la plaque. Ensuite, hachez le derme en morceaux d’un à deux millimètres carrés. Et transférez-les dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Ajoutez 10 millilitres de solution de collagénase de type II dans le tube. Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec une agitation continue à 30 à 50 tr/min pour digérer le derme. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 microns.
Et centrifugez-le à 250 g pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 millimètres de DMEM contenant une solution antibiotique-antimycosique. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 microns avant de la centrifuger, comme démontré précédemment.
Remettez en suspension la pastille de cellule obtenue dans un millilitre de média LEC complet. Ensuite, plaquez les cellules dans un milieu LEC complet dans une plaque de culture tissulaire de 60 millimètres recouverte de collagène. Remplacez le support tous les deux jours en lavant deux fois les cellules avec du PBS et en ajoutant un nouveau support LEC.
Des images à faible grossissement de cellules isolées du derme murin ont montré une population cellulaire mixte.
