Pour commencer, enregistrez un timelapse de GFP endogène Rab3 dans la zone asynaptique de l’axone DA9 dans un Caenorhabditis elegans en direct. Importez le fichier de données timelapse dans Fidji. Vérifiez ensuite qu’il n’y a pas de mouvement ou de légère dérive de l’animal ou du segment axonal lors de l’acquisition de l’image.
Utilisez le plugin StackReg avec une option de transformation de corps rigide pour corriger tout mouvement ou dérive. Utilisez l’outil de ligne segmentée et ajustez la largeur de la ligne pour qu’elle corresponde au diamètre de l’axone. Double-cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’icône de la ligne segmentée pour tracer une ligne le long du segment axonal à analyser.
Maintenant, à l’aide du plugin Fiji KymoResliceWide, générez le kymographe, en définissant la valeur d’intensité maximale sur toute la largeur de la ligne dans ses paramètres de paramètres. À l’aide de l’outil de ligne droite, tracez les événements de transport dans le kymographe. Suivez les événements de transport individuels et enregistrez chaque ligne dans le gestionnaire de retour sur investissement.
Aux Fidji, sélectionnez les paramètres de mesure tels que la surface, le rectangle englobant, la valeur moyenne de gris et le diamètre de Feret. Collez ensuite le tableau des résultats dans une feuille de calcul pour le calcul. Multipliez la largeur par la résolution de l’appareil photo pour obtenir la longueur de course en micromètres.
Pour déterminer la durée d’un mouvement, multipliez la hauteur par le temps d’acquisition entre des points temporels consécutifs. Calculez le temps de pause comme la durée de course entre deux mouvements consécutifs où la vitesse est nulle. Normalisez le nombre total d’événements à la longueur totale du kymographe pour le nombre d’événements par minute et le segment de longueur axonale.
À l’aide de l’outil Angle de furet, classez les événements en transport antérograde et rétrograde. Pour les kymographes générés en traçant la ligne segmentée du proximal au distal, utilisez l’angle de Féret pour déterminer la directionnalité de chaque événement.
