1 Pour commencer, prélevez des cellules de coloration de ligand2 exprimant la protéine d’intérêt marquée au halo et le halo H2B. 3 Après avoir allumé le système de microscope, 4 réglez les paramètres d’incubation des cellules vivantes 5 et laissez le système s’équilibrer. 6 Mettez une goutte d’huile sur 7 un objectif TIRF 100x sur le microscope 8 et chargez l’échantillon de cellule sur la platine du microscope.
9 Pour identifier une cellule morphologiquement saine, 10 ajustez la position Z 11 et imagez l’échantillon cellulaire sous un éclairage en fond clair. 12 Recadrez le champ de vision pour capturer le noyau de la cellule cible. 13 À l’aide de l’éclairage laser, ajustez l’angle TIRF 14 pour obtenir un éclairage hilo avec un rapport signal/bruit optimal 15 d’une seule molécule.
16 Ensuite, réglez le temps d’exposition sur 500 millisecondes. 17 Pendant le temps mort entre les images, 18 photo activent les molécules 19 avec un faisceau de 111 microwatts 405 nanomètres, 20 et pendant chaque exposition, excitent les molécules de halo H2B 21 avec un faisceau de 9,1 milliwatts 640 nanomètres. 22 Lancer la capture d’images pour 2000 images en continu 23 et augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nanomètres 24 lors de la réduction des molécules photoactivées.
25 Pour une protéine d’intérêt marquée d’un halo, 26 répartissez les longueurs d’onde d’émission entre deux caméras 27 à l’aide d’un miroir dichroïque à passage long. 28 Aux mêmes paramètres d’acquisition que ceux démontrés précédemment, 29 ajouter le canal JFX549 pour acquérir une image toutes les 10 secondes 30 et capturer 2000 images en continu.
