Pour commencer, prenez les os du fémur, du tibia, du bassin et de l’humérus isolés d’une souris. Utilisez un scalpel pour couper les plaques de croissance des os longs, en enlevant l’épiphyse. Placez-le dans un plat de 10 centimètres avec du M199 medium plus 2%FBS sur de la glace.
Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 28 et une seringue de 10 millilitres remplie de M199 medium plus 2% FBS pour rincer la moelle dans un tube de 15 millilitres sur de la glace. Placez l’os rincé dans le plat avec l’épiphyse. Laissez le tube de 15 millilitres à la verticale sur de la glace jusqu’à ce que la moelle se dépose.
Retirez ensuite le milieu M199 plus 2 % FBS Ajoutez quatre millilitres du cocktail de dissociation B&M dans le tube de 15 millilitres et incubez dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, récupérez le surnageant et filtrez-le à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube froid de 50 millilitres. Ajoutez deux millilitres de cocktail de dissociation B&M frais à la pastille de moelle osseuse restante et remettez-la dans le bain-marie.
À l’aide d’une pipette d’un millilitre, pipeter vigoureusement les morceaux de moelle osseuse restants. Rassemblez toutes les suspensions cellulaires dans le même tube qu’auparavant. Ajoutez 20 millilitres de milieu M199 avec 0,5 % de BSA et deux millimolaires d’EDTA à la suspension cellulaire.
Ensuite, centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remettre en suspension la pastille dans 500 microlitres de PBS avec un BSA à 0,5% et des anticorps à base de biotine. Incuber sur un agitateur orbital pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Ensuite, faites tourbillonner les perles magnétiques à fond. Ajoutez 25 microlitres de billes dans le tube et incubez à nouveau sur l’agitateur orbital. Placez le tube dans un aimant correspondant pendant deux à trois minutes et recueillez le surnageant dans un tube frais.
Cassez les os en petits morceaux dans le plat de 10 centimètres à l’aide de l’extrémité plate d’un tube de 50 millilitres. Filtrez le surnageant à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres pour isoler les fragments osseux. Coupez les fragments d’os dans la passoire cellulaire avec des ciseaux.
Placez le filtre avec les fragments d’os sur un tube de 50 millilitres et ouvrez le filtre avec le scalpel. À l’aide d’une pince à épiler, transférez la fraction osseuse dans cinq millilitres de mélange de dissociation B&M murin. Placez ensuite le tube horizontalement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec 120 tr/min en secouant pendant 30 minutes.
Après la digestion, ajoutez 25 millilitres de milieu M199 avec 0,5 % de BSA et deux millimolaires d’EDTA. Filtrez le surnageant contenant des cellules stromales à travers une crépine cellulaire de 70 microns dans un tube froid de 50 millilitres.
