Pour commencer, cultivez Escherichia coli dans 5 millilitres de milieu Luria-Bertani, ou LB, dans un tube de culture stérile en polystyrène ou en verre. Incuber le tube pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Sous-culture : la culture cultivée pendant la nuit de 1 à 50 dans 100 millilitres LB dans une fiole conique.
Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant environ 1,5 heure. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de stock de phages T4 à titre élevé dans la culture d’E. coli et incubez à 37 degrés Celsius en agitant pendant trois heures. Une fois que le lysat de phage T4 est clair, recueillez-les dans un tube conique de 50 millilitres.
Centrifuger les lysats à 4 000 g pendant 20 minutes pour granuler les bactéries et les débris cellulaires restants. Filtrez stérilisez le surnageant résultant à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 micron et collectez le filtrat dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ajoutez 0,1 volume de chloroforme au lysat de phage T4 filtré pour tuer les bactéries restantes et empêcher la croissance bactérienne.
Agitez brièvement et incubez le lysat à température ambiante pendant dix minutes. Centrifuger le lysat à 4 000 g pendant cinq minutes pour séparer le chloroforme du lysat. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez soigneusement la couche supérieure de lysat dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Ajouter 13 millilitres de lysat de phage dans le réservoir supérieur du dispositif de filtration centrifuge de 100 kilodaltons. Concentrer le lysat à 4 000 g pendant cinq minutes, ou jusqu’à ce que la majeure partie du lysat soit passée à travers le filtre. À l’aide d’une pipette P200 ou P1000, pipeter doucement les 2 millilitres de lysat restants de haut en bas, dans le réservoir supérieur, pour déboucher la membrane filtrante.
Jeter le filtrat du réservoir inférieur dans un conteneur à déchets. Répéter la concentration et retenir environ 2 millilitres de phage concentré dans le réservoir supérieur. Après le dernier essorage, pipeter doucement le lysat restant de haut en bas, dans le réservoir supérieur.
Pour laver le lysat de phage, ajoutez 12 millilitres de magnésium salin, ou SM, tampon dans le réservoir supérieur et centrifugez à 4 000 g pendant 10 minutes. Après le deuxième lavage, remettre en suspension les 2 millilitres de lysat restants dans le tampon SM jusqu’à un volume final de 10 millilitres. Transférez le lysat dans un tube de 50 millilitres et conservez-le à 4 degrés Celsius.
Pour éliminer les endotoxines contaminantes, ajoutez 0,4 volume de 1-octanol au volume total de lysat. Scellez le couvercle du tube avec un film d’étanchéité et agitez à 120 tr/min pendant une heure, puis incubez à 4 degrés Celsius pendant 1,5 heure sans secouer. Centrifugeuse pour séparer le lysat éliminé des endotoxines du 1-octanol.
Prélevez soigneusement autant de 1-Octanol que possible, à l’aide d’une pipette P1000, et jetez-le dans le conteneur à déchets approprié. À l’aide d’une aiguille de calibre 18 et d’une seringue de 10 millilitres, prélevez le lysat de phage sous la couche restante de 1-octanol. Transférez 1 millilitre d’aliquotes de lysat de phage T4 dans des tubes à microcentrifuger stériles de 1,5 millilitre.
Accélérer la mise sous vide des tubes avec couvercles ouverts à 4 000 g pour évaporer le 1-octanol résiduel du lysat. Préparez une dilution en série de lysat de phage par 10, puis repérez 5 microlitres de chaque dilution sur les plaques de gélose LB et incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez les plaques pour calculer les unités formant des plaques, ou PFU.
Diluez le lysat et le tampon SM obtenus à la concentration souhaitée et le rétiter pour confirmer. Conservez le lysat concentré à 4 degrés Celsius jusqu’à utilisation.
