Pour commencer, positionnez la souris euthanasiée sur la plate-forme chirurgicale. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour retirer délicatement ses paupières. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler incurvée, appliquez une légère pression sur les côtés opposés de l’orbite, ce qui fait saillir l’œil vers l’extérieur.
Utilisez le couteau de la cataracte pour faire une incision soigneuse sur la cornée et utilisez une pince à épiler incurvée pour extraire soigneusement le cristallin. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler incurvée avec des pointes émoussées, transférez les lentilles dans une boîte de culture en plastique de 60 millimètres contenant cinq millilitres de DPBS stérile et de gentamicine. Rincer délicatement les lentilles avec une solution DPBS contenant de la gentamicine.
Une fois le processus de rinçage terminé, placez l’objectif sur un morceau de papier filtre et laissez-le sécher. Une fois que la lentille est bien sèche, transférez-la soigneusement sur le couvercle d’une boîte de Pétri pour préparer le retrait de la capsule de lentille. Faites ensuite pivoter la lentille vers le haut, en vous assurant que le segment antérieur est orienté vers le haut.
Tout en tenant la capsule antérieure avec une pince à épiler, utilisez une pince à capsulorhexis dans la main dominante pour créer une petite déchirure. Tirez doucement les deux outils dans des directions opposées pour retirer la capsule. Placez la capsule dans DPBS jusqu’à ce que toutes les dissections du cristallin soient terminées.
Ensuite, transférez soigneusement la capsule de lentille sur une plaque à six puits. Ajouter un millilitre de solution de trypsine à 0,05 % dans chaque puits pour lancer le processus de digestion enzymatique. Agitez doucement la solution de trypsine pour assurer une perméation uniforme.
Placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et laissez la capsule digérer pendant huit à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Utilisez ensuite des ciseaux à dissection pour hacher soigneusement la capsule de lentille digérée afin de favoriser la séparation cellulaire. Ajouter 0,5 millilitre du milieu de culture contenant 10 % de FBS pour tremper la trypsine.
Transférer les échantillons de tissus dans un tube de centrifugation et centrifuger à 1000 G pendant cinq minutes. Retirez délicatement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Utilisez un millilitre de milieu de culture pour remettre les cellules en suspension et ensemencer les cellules dans une plaque de 24 puits.
L’image de contraste en phase des cellules épithéliales du cristallin en culture a montré qu’entre le troisième et le cinquième jour, les cellules ont commencé leur phase de prolifération. Des phases de croissance rapide et de prolifération logarithmique ont pu être observées entre le septième et le 10e jour.
