1 Après avoir disséqué scBAT2 de la souris euthanasiée, 3 mettez immédiatement le tissu dans un micro-tube à centrifuger. 4 Percez un trou dans le haut du tube avec une aiguille stérile 5 et congelez-le dans de l’azote liquide. 6 Trempez un pilon et une spatule fine dans de l’azote liquide.
7 Versez l’échantillon de tissu congelé instantané 8 du tube de micro-centrifugeuse dans le mortier. 9 Ajoutez une petite quantité d’azote liquide dans le mortier 10 et broyez soigneusement le tissu avec le pilon 11 jusqu’à ce qu’il soit complètement pulvérisé. 12 Utilisez la spatule fine pour gratter et transférer 13 le tissu pulvérisé dans le tube de la micro-centrifugeuse.
14 Une fois que tous les tissus sont transférés, 15 ajoutez 500 microlitres de solution d’isolement d’ARN dans le tube 16 et sonicate pendant 30 secondes à l’aide d’un moteur de pilon à granulés. 17 Ensuite, utilisez une seringue pour pipeter de haut en bas 10 fois 18 pour poux davantage le tissu, 19 en vous assurant qu’aucune particule solide n’est visible. 20 Ajouter 250 microlitres de chloroforme et vortex de temps en temps 21 pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante.
22 Centrifuger les échantillons à 21 000 G pendant 20 minutes 23 à quatre degrés Celsius. 24 Transférez la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube 25 et ajoutez une quantité équivalente de 70 % d’éthanol. 26 Transférez 500 microlitres de lysat 27 dans une colonne de liaison.
28 Centrifuger à 18 000 G pendant 60 secondes 29 et jeter le filtrat. 30 Pour la transcription inverse, ajouter 0,5 à un microgramme 31 d’ARN dilué dans de l’eau traitée au DEPC dans une bandelette tubulaire PCR. 32 Diluer ensuite l’ADNC à 250 nanogrammes par microlitre 33 à l’aide d’eau traitée au DEPC et mettre en place la PCR quantitative.
34 Les niveaux d’expression des gènes marqueurs impliqués 35 dans la médiation de la fonction scBAT étaient relativement similaires 36 entre scBAT et la chauve-souris interscapulaire.
