Pour commencer, ajoutez 264,7 cellules brutes dans une boîte de culture de 100 millimètres et incubez avec six millilitres de DMEM à 37 degrés Celsius avec 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone. Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence, aspirez l’ancien milieu, puis lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS chauffés à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux millilitres de PBS dans chaque boîte contenant des cellules et mélangez-les.
Rassemblez les cellules dans deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, puis centrifugez-les à 377 G pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de PBS. Maintenant, congelez les tubes de microcentrifugation dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’un solide blanc se forme et décongelez immédiatement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.
Centrifugez les tubes à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, prenez deux tubes de microcentrifugation, l’un avec 100 micromolaires de xanthatine et l’autre avec un volume égal de diméthylsulfoxyde. Ajoutez 450 microlitres de surnageant centrifugé dans chaque tube et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Transférez ensuite 60 microlitres de surnageant de chaque tube de microcentrifugation dans 14 tubes PCR. Chauffez les tubes simultanément à différentes températures pendant trois minutes avec deux tubes PCR à chaque température. Placez ensuite les tubes dans la centrifugeuse.
Maintenant, prenez 48 microlitres de surnageant dans chaque tube et ajoutez-les dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 12 microlitres de tampon de chargement de protéines SDS-PAGE dans chaque tube. Chauffez les échantillons vortex dans un bain-marie à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.
