Pour commencer, préparez le gel SDS-PAGE. Faites tourner le marqueur décongelé et les échantillons de test de décalage thermique cellulaire préparés. Ajoutez 2,5 microlitres de marqueur dans le premier puits et 20 microlitres d’échantillons dans chacun des puits restants.
Ensuite, faites fonctionner le gel à 80 volts. Ensuite, ajoutez 850 millilitres d’eau ultra-pure, 100 millilitres d’éthanol anhydre et 50 millilitres de tampon de transfert rapide dans un bécher et mélangez bien. Coupez la membrane de fluorure de polyvinylidène ou de PVDF en fonction de la taille du gel et marquez-la.
Ensuite, faites-le tremper dans du méthanol pendant 30 secondes pour l’activer. Placez les pinces de transfert, le tampon éponge et trois couches de papier filtre de transfert dans un bac contenant le tampon de transfert. Une fois l’électrophorèse terminée, versez la solution d’électrophorèse de l’appareil d’électrophorèse et retirez la plaque.
Retirez délicatement le gel à l’aide d’un couteau en plastique et coupez-le pour visualiser clairement le marqueur protéique et les protéines cibles. Après avoir lavé le gel dans la solution transmembranaire, posez-le à plat sur du papier filtre. Trempez la membrane PVDF activée dans la solution de transfert.
Tenez le côté étiqueté avec une pince à épiler et couvrez le gel face vers le bas. Ensuite, placez l’installation de transfert assemblée dans le réservoir de transfert. Ajouter la solution transmembranaire restante dans la cassette transmembranaire.
Ajustez le courant et l’heure, puis appuyez sur exécuter pour démarrer le transfert à température ambiante. Maintenant, ajoutez six millilitres de solution BSA à 5 % avec TBST dans la boîte d’incubation. Une fois le transfert terminé, retirez la membrane PVDF de l’installation tout en serrant le côté marqueur et placez-la dans la boîte d’incubation.
Après avoir retiré la solution BSA de la boîte de l’incubateur, ajoutez six millilitres d’anticorps primaires. Placez la boîte d’incubation dans une boîte en mousse avec des blocs réfrigérants pendant la nuit tout en secouant. Le lendemain, collectez l’anticorps primaire dans un tube et lavez la membrane avec six millilitres de solution TBST.
Ensuite, ajoutez six millilitres d’anticorps secondaires dans la boîte d’incubation. À la fin de l’incubation, prélevez l’anticorps secondaire et lavez la membrane cinq fois avec du TBST, comme indiqué précédemment. Mélangez des volumes égaux de réactifs chimiluminescents A et B.Ouvrez le système d’imagerie sur gel.
Cliquez sur les échantillons, vérifiez l’étalonnage et attendez la fin de l’étalonnage. Ensuite, cliquez sur marqueur et vérifiez le calibrage. Maintenant, prenez le côté marqueur de la bande à l’aide d’une pince à épiler et immergez-le complètement dans la solution de réactif chimiluminescent.
Fixez un côté du marqueur pour placer la bande face vers le bas dans l’imageur et fermez le couvercle de l’imageur. Réglez le temps d’exposition sur une seconde, puis cliquez sur Capturer. Cliquez sur Enregistrer.
Nommez l’image et enregistrez-la en tant que fichier TIFF. L’essai de décalage thermique cellulaire a montré que la xanthatine modifie remarquablement la stabilité thermique de la protéine Keap1 dans la plage de température de 48 à 57 degrés Celsius par rapport au groupe diméthylsulfoxyde.
