Pour commencer, préparez 10 millilitres de tampon de réaction 2X AlkB et stérilisez à travers un filtre à seringue de 0,2 micron. Dans un tube PCR stérile, ajoutez 20 microlitres d’ARN ligaturés 1 de liaison, 50 microlitres de tampon de réaction AlkB 2X, deux microlitres de déméthylase AlkB, un microlitre d’inhibiteur d’ARN et 27 microlitres d’eau libre d’ARN pour préparer la réaction de digestion d’AlkB. Incuber le mélange de digestion AlkB à température ambiante pendant deux heures pour éliminer la méthylation post-transcriptionnelle des ARN.
Pour une séparation de phase propre, ajoutez 50 microlitres d’eau sans ARN dans la réaction AlkB. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de mélange de phénol, de chloroforme et d’alcool isoamylique. Secouez le tube pendant 10 secondes.
Centrifugez le mélange AlkB à 16 000 G pendant 10 minutes. Transférez environ 140 microlitres de la couche aqueuse supérieure contenant des ARN dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Pour éliminer le phénol résiduel, ajoutez 100 microlitres de chloroforme aux ARN extraits et secouez le tube.
Centrifugez le mélange à 16 000 G pendant 10 minutes et transférez environ 120 microlitres de la couche aqueuse supérieure dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Après la réaction de transcription inverse, ajoutez un microlitre de hydroxyde de sodium à cinq molaires dans l’hybride d’ADNc d’ARN. Incuber à 93 degrés Celsius pendant trois minutes pour hydrolyser le brin d’ARN de l’hybride d’ADNc.
Ensuite, ajoutez 0,77 microlitre d’acide chlorhydrique à cinq molaires pour neutraliser la réaction. Préparez un gel d’agarose à 3 % dans un tampon TAE. Mélangez un microlitre de colorant de chargement 6X dans cinq microlitres de produit PCR et chargez le gel avec le mélange.
Chargez cinq microlitres d’échelles d’ADN de 50 ou 100 paires de bases dans le puits avant le premier échantillon et le puits après le dernier échantillon. Exécutez l’électrophorèse sur gel à 120 volts et 400 milliampères pendant 75 minutes pour localiser les produits PCR. Après l’électrophorèse, placez le gel dans une boîte et remplissez-le d’eau déminéralisée jusqu’à ce que le gel soit complètement immergé.
Ajoutez 10 microlitres de bromure d’éthidium dans l’eau. Enveloppez la boîte avec du papier d’aluminium et teignez pendant 30 minutes sur un shaker. Jetez l’eau contenant du bromure d’éthidium dans une bouteille usagée placée dans une hotte.
Rincez une fois le gel à l’eau déminéralisée et jetez l’eau dans une bouteille à déchets. Après avoir lavé le gel avec de l’eau déminéralisée pendant 10 minutes, utilisez un imageur de gel pour visualiser les bandes et acquérir une image haute résolution du gel.
