Analyse de la fonction mitochondriale dans de petites colonies de Candida glabrata induites par le bromure d’éthidium

Pour commencer la culture de Candida glabrata, disposez tout le matériel expérimental sur la plate-forme de travail. Prélever une seule colonie de C. glabrata dans une plaque de levure, de peptone dextrose ou de gélose YPD. Et transférez-le dans un tube à essai en verre contenant 3 millilitres de milieu YPD.

Incuber pendant 14 à 16 heures à 25 degrés Celsius en secouant à 155 tr/min. Après l’incubation, diluer la culture dans du YPD frais pour obtenir une densité optique de 600 nanomètres de 0,1. Incuber la culture diluée à 25 degrés Celsius pendant six heures en agitant à 155 tr/min.

Préparez une suspension de levure à une densité optique de 600 nanomètres de 0,1 en YPD à 3 millilitres. Ajoutez 30 microlitres de bouillon de bromure d’éthidium et incubez la suspension de levure pendant la nuit à 25 degrés Celsius à 155 tr/min à un angle de 45 degrés. Le lendemain, ajustez la densité optique de la culture à 0,65 avec un milieu YPD frais.

Dans une plaque à 96 puits, ajoutez 20 microlitres de suspension de levure à 180 microlitres de PBS par puits pour une dilution décuplée. Plaque de 20 microlitres de chaque dilution sur quatre quadrants de la plaque de gélose YPD. Incuber l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, sélectionnez des quadrants de cinq à 80 colonies et ajoutez 20 microlitres de tétrazolium de triphényle à 20 %. Et ajoutez 20 microlitres de chlorure de tétrazolium à 20% de triphényle directement au centre de chaque colonie. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes.

Numérisez des plaques à 1200 DPI à l’aide d’un scanner optique couleur 48 bits. L’agent intercalateur de l’ADN, le bromure d’éthidium, induit efficacement de petits mutants de C. glabrata.