Pour commencer, placez le support de la culture Candida Glabrata et de la YPD sur une plate-forme de travail. Ajustez la densité optique de la suspension de cellules de levure à 600 nanomètres à 0,65 avec le milieu YPD. Mélangez un millilitre de suspension de levure avec 111 microlitres de 2% de Rose Bengal dans un tube rond bouché.
Incuber le mélange à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes, en tournant à un angle de 45 degrés à 155 tr/min. Après l’incubation, transférez le mélange dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez-le à 16,100 G pendant 2,5 minutes. Jetez le surnageant et raclez doucement le tube cinq fois pour remettre la pastille en suspension.
Lavez la suspension avec du PBS quatre fois pour enlever tout le Rose Bengal. Après le lavage final, transférez 200 microlitres de suspension de levure chargée de Rose Bengal dans chacun des trois puits dans une plaque à 96 puits. Positionnez la plaque sur le système d’éclairage photodynamique avec des ampoules LED qui brillent en vert par le bas.
Activez le système d’éclairage LED pour délivrer la dose de thérapie photodynamique de 4,38 joules par centimètre carré pendant deux minutes. Après irradiation, ajoutez 20 microlitres de suspension de levure dans un puits contenant 180 microlitres de PBS, créant ainsi une dilution décuplée. Pour chaque facteur de dilution, plaque 20 microlitres par quadrant sur les plaques de tarière YPD.
Retournez l’assiette et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez le nombre de colonies dans chaque quadrant. À l’aide de la formule donnée, calculez les unités formant colonie par millilitre.
Ajoutez 20 microlitres de chlorure de tétrazolium de triphényle à 20 % directement au centre de chaque colonie et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes. Numérisez des plaques à 1 200 DPI à l’aide d’un scanner optique couleur 48 bits. Après avoir préparé la suspension de levure TZero dans la phase de retard de croissance, exposez-les à 4,38 joules par centimètre carré de lumière verte en présence de 0,2% de rose Bengale.
Désignez les champignons survivants par T-1. Exposez les champignons survivants à la même dose de PDT. Les petits mutants de C-Glabrata ont montré une croissance plus lente par rapport aux champignons parentaux non traités de taille normale.
Un seul traitement de thérapie photodynamique antimicrobienne a inhibé de manière significative la croissance de C-Glabrata de trois décalages par rapport au contrôle. C-Glabrata, 24 heures après le traitement de thérapie photodynamique antimicrobienne, a montré une distribution bimodale de la taille des colonies avec de grandes et petites colonies. Les petites colonies qui ont conservé une couleur blanche ont présenté un dysfonctionnement mitochondrial, tandis que certaines colonies plus petites de couleur rouge et des colonies de taille normale ont conservé une fonction mitochondriale normale.
