Pour commencer, prenez des cultures de 12 jours de cellules souches pluripotentes humaines qui ont été soumises à l’induction de la crête neurale. Aspirez doucement le milieu C des cellules. Ajoutez 100 microlitres de PBS par centimètre carré de surface de puits pour laver les cellules, puis retirez le PBS.
Ajoutez un volume égal de solution de détachement cellulaire aux cellules et incubez pendant 30 minutes sous une supplémentation en dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius. Ajouter un volume égal de milieu NCC dans la plaque. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, prélevez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres.
Faites tourner les cellules à 290 G pendant deux minutes entre 20 et 25 degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, pipeter 12 millilitres de milieu NCC sur la pastille de cellule.
Pipetez mécaniquement la suspension de haut en bas pour créer une suspension. Ensuite, transférez la suspension cellulaire sur une plaque de fixation ultra basse. Le 14e jour, faites tourner doucement les plaques de culture cellulaire pour recueillir de petits sphéroïdes au centre de chaque puits.
À l’aide d’une micro-pipette P1000, aspirez lentement le milieu usé de la circonférence de chaque puits. Alimentez à nouveau les cellules avec le volume d’origine de milieu NCC. Le 15e jour, retirez délicatement le milieu.
Ajoutez du PBS dans les puits pour laver les sphéroïdes. Ensuite, retirez autant de PBS que possible, en vous assurant que les sphéroïdes ne sont pas dérangés. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de détachement cellulaire par centimètre carré de surface de puits.
Incuber les cellules dans la solution pendant 30 minutes à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, ajoutez un volume égal de milieu ENC dans chaque puits. Pipetez mécaniquement la solution pour casser les sphéroïdes restants.
Transférez ensuite les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Jetez le surnageant après la centrifugation comme précédemment. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 5 à 10 millilitres de milieu ENC.
Comptez la concentration de cellules viables à l’aide du bleu de trypan et de l’hémocytomètre. Maintenant, ajoutez suffisamment de volume de milieu ENC pour plaquer environ 300 000 à 400 000 cellules viables par centimètre carré de surface, et une densité d’environ 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, aspirez les solutions des puits.
Ensuite, ajoutez les cellules à une plaque avec des puits recouverts de laminine PO/FN. Nourrissez les cellules tous les deux jours avec 200 microlitres de milieu ENC par centimètre carré de surface de puits jusqu’aux jours 30 à 40. Des sphères flottantes de haute qualité avec des surfaces lisses ont été observées après l’induction de la crête neurale.
Les sphéroïdes exprimaient le marqueur de crête neurale SOX10. Des neurites ont été observées entre les jours 25 et 30 lors de l’induction des neurones entériques.
