Préchauffer un millilitre de bouillon LB et une plaque de gélose LB plus gentamicine pour chaque échantillon et contrôler dans un incubateur statique réglé à 37 degrés Celsius. Dans un volume combiné de cinq microlitres ou moins, ajouter 100 à 200 nanogrammes chacun du plasmide auxiliaire pTNS2 et du plasmide d’insertion de gentamicine adeIJK pUC18-Tmini-Tn7-Tlac à une aliquote de cellules électrocompétentes. Mélanger en tapotant doucement du bout des doigts pour assurer un mélange complet des plasmides avec les cellules électrocompétentes sans introduire de bulles.
Ajouter un volume équivalent d’eau distillée stérile dans l’aliquote de la cellule témoin négative et mélanger doucement comme indiqué précédemment. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes. Transférez l’échantillon entier de la cellule dans une cuvette d’électroporation glacée, puis replacez la cuvette sur de la glace.
Pour électroporer l’échantillon de cellule, allumez l’électroporateur et réglez-le sur deux kilovolts. Essuyez la surface de la cuvette avec un mouchoir en papier pour éliminer toute glace ou humidité adhérente. Insérez la cuvette dans l’électroporateur et délivrez le choc électrique.
Ajoutez immédiatement 0,9 millilitre de bouillon LB préchauffé dans les cellules de la cuvette et pipetez doucement de haut en bas pour mélanger les cellules avec le milieu. Transférez l’ensemble de la suspension cellulaire dans un nouveau tube microfuge de 1,5 millilitre à température ambiante. Vérifiez ensuite la valeur de la constante de temps sur l’électroporateur.
Pour de meilleurs résultats, cette valeur doit être comprise entre quatre et six. Incuber les échantillons électroporés à 37 degrés Celsius pendant une heure à 250 tr/min pour permettre la récupération des cellules. Après une heure, étalez 100 microlitres de chaque échantillon sur une plaque de gélose LB plus gentamicine préchauffée, à l’aide d’un épandeur d’inoculation.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Vérifiez les plaques d’électroporation. À l’aide de cure-dents stériles, prélevez jusqu’à 10 colonies individuelles dans les plaques de gélose LB plus gentamicine et patchez-les sur une nouvelle plaque de gélose LB plus gentamicine.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Le patchage des colonies de plaques de transformation sur des milieux sélectifs préserve la souche transformée et fournit du matériel de départ pour le criblage PCR des colonies. Le produit PCR pour les amorces de criblage, ABglmS2 forward new et Tn7 reverse est de 382 paires de bases.
Les témoins négatifs de la réaction comprennent le type sauvage A. baumannii ATCC 17978, AB 258, et aucun modèle.
