Pour commencer, obtenez un virus clarifié à partir de cellules cultivées. Placez les tubes ultracentrifuges dans un rack du côté de sortie de la pompe péristaltique multicanal. À l’aide d’une pipette sérologique, versez soigneusement 10 millilitres de virus clarifié dans chaque tube d’ultracentrifugation.
Ensuite, transférez 22 millilitres de la fraction d’iodixanol à 15 % dans un tube conique propre de 50 millilitres. Placez les capillaires sur le côté droit de la pompe dans le tube et démarrez la pompe. Arrêtez la pompe.
Lorsque la fraction d’iodixanol atteint l’extrémité des capillaires du côté de sortie de la pompe, insérez un capillaire de sortie dans chaque tube d’ultracentrifugation avec le virus clarifié et démarrez la pompe. Arrêtez la pompe lorsque la dernière fraction de 15 % est sur le point d’être acheminée dans les capillaires d’entrée. Ensuite, transférez 22 millilitres de la fraction d’iodixanol à 25 % dans le tube conique de 15 millilitres.
Après avoir allumé la pompe, laissez toute la fraction être acheminée dans les capillaires d’entrée et arrêtez la pompe. Si nécessaire, ajoutez plus de la fraction à 60 % et remplissez chaque tube jusqu’à ce que le lysat forme un dôme sur le dessus mais ne déborde pas. Arrêtez la pompe et retirez soigneusement le capillaire de sortie.
Fermez le tube de l’ultracentrifugeuse avec une entretoise et chargez-le dans un rotor TI de type 70. Après centrifugation, fixez le tube de l’ultracentrifugeuse à un support de support. À l’aide d’une lingette non pelucheuse, retirez le capuchon du tube de l’ultracentrifugeuse.
Ensuite, fixez une aiguille de calibre 20 à une seringue de 5 millilitres et pénétrez dans la paroi du tube d’ultracentrifugation avec l’aiguille à environ 3 millilitres sous l’interface entre 40 et 60 % d’iodixanol. Aspirez lentement l’interface et une partie de la fraction de 40 %. En tenant un doigt sur le dessus ouvert du tube de l’ultracentrifugeuse, retirez la seringue et transférez la fraction AAV aspirée dans un tube conique de 50 millilitres.
Enfin, diluez la fraction virale aspirée deux fois dans un tampon de lyse AAV à un volume de 40 millilitres. Après avoir rincé un tube péristaltique, chargez 20 millilitres de la fraction AAV diluée dans un nouveau tube d’ultracentrifugation pour le deuxième cycle de fractionnement.
